低盐榨菜混菌强化发酵工艺研究

袁乐梅，肖雄峻，边名鸿，曾洪，陈强，张旭，杨中元

(1.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000)

榨菜的原料青菜头，学名“茎瘤芥”，分布于我国各地，收藏季节短，不易保存，因此大部分用于制作榨菜[1]。榨菜以独特的加工工艺和脆嫩芳香的特点深受国内外消费者喜爱。但传统自然发酵榨菜的盐含量高并且存在大量亚硝酸盐，不符合现代社会追求的绿色生活方式。少量的亚硝酸盐可与蛋白质中的仲胺结合生成亚硝胺，有导致人体致癌的作用，而大量的亚硝酸盐可导致肠原性青紫症[2]。榨菜腌制中还存在有害微生物，使成品榨菜产生不良气味，发生“涨袋”等现象[3]。而传统榨菜的脱水方式分为风脱水和盐脱水，其含盐量均在12%以上，不符合世界卫生组织建议的每日摄入食盐量[4]。有研究表明，榨菜含盐量的降低、酸度的提高以及乳酸菌对亚硝酸盐的降解作用等都可以降低榨菜中的亚硝酸盐含量[5]。另外，创造有利于乳酸菌、酵母菌等有益菌生长的微生态条件，控制腌制中的理化因素都可以用来调控发酵过程，以达到改善榨菜风味和质量的目的[6]。随着这一发展趋势，榨菜的研究越来越趋于低盐化和接种发酵[7,8]。

本试验将植物乳杆菌和汉逊酵母接种于低盐榨菜发酵，植物乳杆菌产酸，汉逊酵母产香产酯，代替传统高盐榨菜的发酵模式，探究新型低盐榨菜发酵工艺；采用热风烘脱水，可短时间降低榨菜的含水量，增加榨菜的脆度。加入氯化钙，榨菜中的果胶酸与氯化钙中的钙离子结合生成不溶性的钙盐，从而弥补了乳酸菌接入导致榨菜脆度下降的缺陷，同时也保持了榨菜的形状；白酒中含有酸类、酯类、醇类、芳香族化合物、缩醛类化合物等，为榨菜发酵增香提供了一定的前体物质，使产品产生独特的滋味和芳香，另外白酒中的酒精也能产生较高的渗透压和较强的杀菌能力，从而抑制了杂菌的生长，减少了防腐剂的使用。功能菌强化发酵技术应用于低盐发酵蔬菜，对提升传统产业水平和促进酱腌菜的现代化发展具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

青菜头：购于自贡市一对山菜市场，经洗净、修整、清洗、切条、热风烘脱水、加盐、氯化钙、发酵菌接种发酵、包装、后熟等处理；食盐：自贡市燊海旅游开发有限责任公司生产的泡菜粒状盐；氯化钙：浙江大成钙业有限公司生产的食品级添加剂；白酒：北京红星股份有限公司生产的56度红星二锅头。

1.1.2 菌种

植物乳杆菌B1：从川西彝族传统酸菜汁中分离所得；汉逊酵母Y2：四川轻化工大学酿酒生物技术及应用四川省重点实验室保存。

1.1.3 培养基

MRS培养基：葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二铵2 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，吐温80 1 mL，加水定容为1000 mL，pH 6.2±0.2；用于发酵乳酸菌的扩大培养。

YPD培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，加水定容为1000 mL，pH 6.8±0.4；用于发酵酵母菌的扩大培养。

1.1.4 仪器

PHS-2C精密pH计 上海虹益仪器仪表有限公司；AX224ZH/E电子天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司；WGZ精密鼓风干燥箱 上海科恒实业发展有限公司；HS-2数显恒温水浴锅 太仓市华利达实验设备有限公司；TA-XT Plus质地分析仪 超技公司；756型紫外可见分光光度计 上海奥谱勒仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 榨菜腌制工艺

1.2.1.1 低盐榨菜发酵工艺流程

1.2.1.2 传统自然发酵榨菜工艺流程

鲜菜→修整→清洗→自然风干脱水→加盐初腌→脱水→加盐复腌→入坛发酵→成品菜胚。

1.2.2 低盐榨菜工艺操作要点

1.2.2.1 预处理

摘除鲜菜中的杂物，清洗干净后切成宽度为1～1.5 cm的菜条。

1.2.2.2 热风烘脱水

将菜条置于温度为60～65 ℃的环境中，在0.5～1.0 m/s的风速下脱水5～6 h，使菜条含水量降至75%以下，得脱水菜条。

1.2.2.3 加入食盐、氯化钙和白酒

将占脱水菜条质量4%～8%的食盐、0.15%～0.45%的氯化钙和1%～4%的白酒加入脱水菜条中，拌匀后腌制2～4 h。

1.2.2.4 喷洒接种

将占脱水菜条质量3‰～6‰的混合发酵液喷洒接种到腌制后的脱水菜条中，拌匀使菜条无成团现象；所述混合发酵液包括质量比为1∶1～2∶1的植物乳杆菌发酵液和汉逊酵母发酵液。

1.2.2.5 脱水

将经过1.2.2.4处理的菜条装入发酵容器中，密闭发酵25～30 d后取出榨菜，对榨菜进行脱水处理，将其含水量控制在60%～65%。

1.2.2.6 装袋灭菌

将脱水后的榨菜装袋、热封，再进行巴氏杀菌，得榨菜成品。

1.2.3 菌株的扩大培养

以2%的接种量分别接种植物乳杆菌B1和汉逊酵母Y2至MRS和YPD液体培养基中，分别于37，30 ℃恒温培养，用平板菌落计数法进行计数，当菌悬液中的细胞数达到108CFU/mL时到达扩培终点。将扩培后的菌悬液于4000 r/min的条件下离心15 min，洗涤，去除培养基对后续发酵的影响[9]。

1.2.4 传统自然发酵、乳酸菌、混菌强化低盐榨菜发酵对比分析

传统自然发酵(A)：按照传统自然发酵榨菜工艺进行发酵，初腌时加入6%的盐，复腌时加入5%的盐进行腌制；乳酸菌(B)、混菌(C)强化低盐榨菜发酵：接种量为6‰，混菌发酵比例(植物乳杆菌∶汉逊酵母)为1∶1，65 ℃条件下低风速脱水6 h使榨菜的含水量降至75%，6%加盐量，0.25%氯化钙，3%白酒。3种榨菜均在25 ℃室温下培养，每隔3 d取样，测定OD值、酸度。当盐度基本趋于一致、榨菜颜色均匀时发酵结束，测定3种榨菜的质构并进行感官品评。

1.2.5 低盐榨菜发酵条件单因素试验

1.2.5.1 接种量的确定

将清洗、修整好的鲜菜在65 ℃条件下低风速脱水6 h后，分别加入质量分数为2‰、4‰、6‰、8‰的乳酸菌菌悬液，按照1.2.4所示的乳酸菌强化低盐榨菜发酵工艺，于室温下培养40 d，每隔5 d取样，测定其OD值、酸度，腌制结束后对其进行感官品评。

1.2.5.2 混菌发酵比例的确定

以6‰的接种量，植物乳杆菌∶汉逊酵母分别为0∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶0的比例喷洒接种到腌制后的脱水菜条中，按照1.2.4所示的混菌强化低盐榨菜发酵工艺，于室温下培养40 d，每隔5 d取样，测定其OD值、酸度，腌制结束后对其进行感官品评。

1.2.5.3 白酒添加量的确定

鲜菜烘脱水至含水量75%以下后，分别按质量分数加入1%、3%、5%、7%的白酒，按照1.2.4所示的乳酸菌强化低盐榨菜发酵工艺，于室温下培养40 d，每隔5 d取样，测定其OD值、酸度，腌制结束后对其进行感官品评。

1.2.5.4 氯化钙添加量的确定

鲜菜在65 ℃条件下烘脱至含水量为75%以下后，添加3%的白酒后加入质量分数为0.1%、0.25%、0.4%、0.55%的氯化钙，按照1.2.4所示的乳酸菌强化低盐榨菜发酵工艺，于室温下培养40 d，每隔5 d取样，测定其OD值、酸度，腌制结束后对其进行感官品评。

1.2.6 新型低盐榨菜发酵条件优化正交试验

为了得到最适发酵条件，采用混菌强化低盐榨菜发酵，在单因素试验基础上，设置三因素三水平的正交试验，以观察接种量(A)、混菌发酵比例(B)、白酒添加量(C)对榨菜品质的影响，各因素的水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.7 优化条件与传统自然发酵榨菜理化指标和感官评分对比

以最优条件进行验证试验，每隔3 d测定其酸度和OD值，并将发酵完成后最优条件的质构、发酵完成时间、含盐量、氨基酸态氮、蛋白质、还原糖、亚硝酸盐等含量与传统自然发酵榨菜进行对比，以验证感官品评的结果。其他条件遵循低盐榨菜发酵工艺流程，选取新鲜原料进行发酵。

1.3 测定方法

1.3.1 感官品评方法

参考张赟彬等[10]的方法，其中色泽∶香气∶滋味的分值比例为2∶3∶5。

1.3.2 榨菜理化指标测定方法

1.3.2.1 榨菜酸度的测定

使用PHS-2C精密pH计直接测定腌制榨菜卤水[11]。

1.3.2.2 盐度的测定

参照GB 5009.44-2016进行，采用其中的直接滴定法，在2次重复性的试验中，测试结果的绝对差值应小于算术平均值的5%。

1.3.2.3 氨基酸态氮的测定

采用酸度计法，具体操作流程参照GB 5009.235-2016。其中榨菜样品的处理方式为取20 g榨菜样品研细，混合均匀，采用四分法，取5 g进行氨基酸态氮的测定。

1.3.2.4 质构分析方法

用质构测定仪分析榨菜条，使用P/2N探头，测前后速率2 mm/s，测中速率1 mm/s，穿刺距离4 mm，从榨菜坛的四角和中部共取5组榨菜条为样品进行分析[12]。

1.3.2.5 其他指标

蛋白质含量的测定：采用常量凯氏定氮法[13]；还原糖含量的测定：采用斐林试剂法；亚硝酸盐含量的测定：参照GB 5009.33-2016中分光光度法下的盐酸奈乙二胺法。

2 结果与分析

2.1 3种腌制榨菜卤水细胞浓度(OD值)的变化

图1 榨菜腌制过程中细胞浓度变化Fig.1 Changes of cell concentration during pickle salting process

从榨菜腌制开始，每隔3 d取榨菜的卤水于600 nm波长处测定其吸光度值，以腌制0 h时的卤水为参比。由图1可知，腌制开始后，接种强化低盐榨菜中的细胞浓度远高于传统自然发酵榨菜，其中混菌强化低盐榨菜发酵的细胞浓度增长最快，并在短时间内细胞浓度趋于平稳；植物乳杆菌单菌强化发酵的细胞浓度刚开始时高于传统自然发酵，但当发酵进行至21 d时，其细胞浓度略低于传统自然发酵，主要原因是长时间的榨菜腌制导致卤水中的营养环境发生变化，植物乳杆菌进入稳定期并慢慢走向衰亡。植物乳杆菌和汉逊酵母混菌强化低盐榨菜发酵加速了榨菜的后熟，有利于缩短榨菜的发酵周期[14]。

2.2 3种腌制榨菜卤水酸度的变化

图2 榨菜发酵过程中酸度变化曲线Fig.2 The curves of acidity changes during pickle salting process

由图2可知，菌株强化发酵使得发酵菌株快速成为优势菌株，初期pH快速下降，下降速度远远快于传统自然发酵组，发酵20天左右时pH便降至4以下，从而达到抑制腐败菌的作用，而传统自然发酵组直至发酵完成，pH值也只在4.5左右徘徊；混菌强化发酵组的pH值则一直低于乳酸菌强化发酵组，pH值在发酵终点时达到3.6左右。在混菌强化发酵组中，由于植物乳杆菌和汉逊酵母的接入，使得植物乳杆菌在发酵开始就处于优势地位，加之汉逊酵母自身发酵产香产酯，多菌株酶系丰富，保证了发酵的正常进行，使底物分解更彻底，从而提升了产品的品质[15]。

2.3 3种榨菜菜胚质构分析

榨菜的成品测定数据见表2。

表2 榨菜成品测定数据Table 2 Determination data of pickle products

由表2可知，植物乳杆菌强化发酵组发酵周期为30 d，低于传统自然发酵组(42 d)，平均内部脆度高于传统自然发酵组，混菌强化发酵榨菜品质和感官评分均优于单菌强化发酵和传统自然发酵，发酵完成时间为30 d，脆度和粘度均有提高，感官品评结果最好。

2.4 单因素试验结果分析

2.4.1 接种量试验结果分析

图3 榨菜腌制过程中细胞浓度变化Fig.3 Changes of cell concentration duringpickle salting process

由图3可知，乳酸菌发酵榨菜的细胞浓度均高于不接种乳酸菌榨菜，但发酵15 d后，榨菜卤水的细胞浓度增长变缓，其中接种量为6‰的榨菜细胞浓度最高。

图4 榨菜发酵过程中酸度变化曲线Fig.4 The curves of acidity changes duringpickle salting process

由图4可知，乳酸菌的添加降低了榨菜卤水的pH，其中接种量为6‰的条件下，卤水的pH值下降最快，发酵结束时pH低至4以下。

表3 感官品评得分Table 3 Sensory evaluation score

由表3可知，发酵榨菜感官评分更优的榨菜为6‰条件下的低盐发酵榨菜。结合pH、细胞浓度和感官评分3项指标，接种量为6‰的榨菜表现出较好的特性。

2.4.2 混菌接种比例试验结果分析

图5 榨菜腌制过程中细胞浓度变化Fig.5 Changes of cell concentration duringpickle salting process

由图5可知，植物乳杆菌∶汉逊酵母比例为1∶1、0∶3、3∶0的条件下榨菜卤水均有较高的细胞浓度，但比例在1∶1时，细胞浓度增长速率较快，能较好地抑制其他有害微生物的生长繁殖。

图6 榨菜发酵过程中酸度变化曲线Fig.6 The curves of acidity changes duringpickle salting process

由图6可知，接入发酵菌的榨菜卤水pH值在发酵5 d后均有明显的降低，随着发酵时间的延长，混菌比例为1∶1的榨菜卤水pH值较低，发酵20 d后pH降至4以下。

表4 感官品评得分Table 4 Sensory evaluation score

由表4可知，混菌比例为1∶1的榨菜感官评分较高。结合pH、细胞浓度和感官评分3项指标，混菌比例为1∶1的榨菜表现出较好的特性。

2.4.3 白酒添加量试验结果分析

榨菜的发酵过程伴随着酒精发酵，其后熟阶段，由于酒精的酯化作用，促使产品产生独特的风味物质。酒精也能产生较高的渗透压，有较强的杀菌和保藏能力。为了提高榨菜的防腐能力和增加榨菜的风味物质，减少榨菜中防腐剂的使用，在榨菜中加入适量白酒，探索其对榨菜品质的影响。

图7 榨菜腌制过程中细胞浓度变化Fig.7 Changes of cell concentration duringpickle salting process

由图7可知，发酵榨菜的细胞浓度随着白酒添加量的增加而降低，白酒添加量为1%和3%时能保持较高的细胞浓度；当白酒添加量为5%时，菌体生长明显受到抑制，不利于发酵的进行。

图8 榨菜发酵过程中酸度变化曲线Fig.8 The curves of acidity changes during pickle salting process

由图8可知，榨菜卤水的pH随着白酒添加量的增加而降低，白酒添加量为0%、1%、3%、5%时，榨菜发酵后期pH值均较低，但5%白酒添加量的榨菜pH值在发酵10～35 d时较高。

表5 感官品评得分Table 5 Sensory evaluation score

由表5可知，白酒添加量为3%时，榨菜的感官评分较高。结合pH、细胞浓度和感官评分3项指标，添加3%白酒的榨菜品质最好。

2.4.4 氯化钙添加量试验结果分析

加入氯化钙，榨菜中的果胶酸与氯化钙中的钙离子结合生成不溶性的钙盐，从而提升榨菜的脆度，缓解成品榨菜软化等问题；但添加过量的氯化钙会造成低盐榨菜口味变苦、含水量降低、氯离子过量等不良影响。

图9 榨菜腌制过程中细胞浓度变化Fig.9 Changes of cell concentration duringpickle salting process

由图9可知，随着氯化钙添加量的增加，榨菜中的细胞浓度受到一定的抑制，特别是当氯化钙的添加量为0.4%和0.55%时，最终的细胞浓度降至0.2左右。

图10 榨菜发酵过程中酸度变化曲线Fig.10 The curves of acidity changes duringpickle salting process

由图10可知，氯化钙的添加对榨菜的pH影响不显著。

表6 感官品评得分Table 6 Sensory evaluation score

由表6可知，0.25%氯化钙的榨菜成品感官评分较好。结合上述3种指标，选取0.25%氯化钙加入榨菜发酵中。

2.5 正交试验结果分析

2.5.1 正交试验结果

根据低盐榨菜发酵工艺流程，采用正交试验设计方法优化发酵条件，结果见表7。由直观分析法可知几种发酵条件对低盐榨菜感官质量的影响顺序为：接种量>白酒添加量>混菌比例(植物乳杆菌∶汉逊酵母)；最优的发酵条件为A2B2C1，即6‰接种量、混菌比例1∶1、白酒添加量2%。

表7 正交试验结果分析Table 7 Analysis of orthogonal experimental results

2.5.2 方差分析

表8 影响榨菜感官评分方差分析表Table 8 Variance analysis table of sensory score of pickle

通过方差分析各因素对正交试验的影响，由表8可知，接种量对低盐榨菜的感官质量有显著性的影响(P<0.05)，而混菌比例和白酒添加量对低盐榨菜的感官质量影响不显著。

2.5.3 验证试验

选择混菌强化低盐榨菜发酵，加盐量为6%，氯化钙添加量为0.25%，当菌体浓度达到108CFU/mL时喷洒接种至榨菜中。以榨菜含盐量、氨基酸态氮、蛋白质、还原糖、亚硝酸盐等指标对比分析优化后低盐榨菜与传统榨菜的品质，结果见表9。

表9 强化发酵与传统自然发酵榨菜指标对比Table 9 Quality indexes comparison of pickles by enhanced fermentation and traditional natural fermentation

由表9可知，强化发酵榨菜发酵周期明显缩短，氨基酸态氮含量高于传统自然发酵产品，且其亚硝酸盐含量明显降低，脆度和感官评分显著提升。强化发酵的低盐、低pH环境以及植物乳杆菌的接入对腌制榨菜亚硝酸盐的产生有一定抑制作用，使榨菜的亚硝酸盐控制在较低的水平[16]。

3 结论

本试验选取植物乳杆菌和汉逊酵母作为发酵菌强化低盐榨菜发酵，与植物乳杆菌单菌强化发酵组相比，混菌强化发酵组风味多样，其感官品质优于自然发酵组。经过单因素试验和正交优化试验，得到最优发酵条件：6‰接种量、混菌比例(植物乳杆菌∶汉逊酵母)1∶1、白酒添加量2%、发酵28 d。该条件下生产的低盐榨菜产品的蛋白质、还原糖含量与传统自然发酵制品无明显差异，氨基酸态氮含量高于传统自然发酵，而亚硝酸盐含量则明显降低，这一结论与He等[17]、曾凡坤等[18]的研究结果一致。付晓红等在混菌接种发酵对低盐榨菜的影响中发现混菌接种发酵榨菜的感官品质优于自然发酵榨菜[19]，本试验验证结果表明，优化条件发酵制品各项质量指标均优于传统自然发酵制品，产品质量稳定，脆度高，感官评价也较好。混菌强化发酵研究为直投式发酵剂的研制提供了生产工艺参数，对低盐榨菜行业的发展有较积极的指导意义。