枣庄黑盖猪亲缘关系分析及分子系谱构建

2019-09-16王继英成建国王彦平赵雪艳朱晓东谢晋堂方美英

猪业科学 2019年8期

王继英，成建国，林松，王彦平，赵雪艳，武英，朱晓东，谢晋堂，方美英

（1. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 250100；2.山东春藤食品有限公司枣庄黑盖猪原种猪场，山东枣庄 277100；3.中国农业大学动物科技学院，北京 100193）

畜禽系谱记录的准确性对控制畜禽近交系数增加、遗传改良至关重要。由于未知血缘个体的引进、记录过程中的人为失误等原因，系谱记录错误在畜禽生产、育种和保种过程中普遍存在。奶牛的系谱研究最多。Banos 等[1]研究表明国外奶牛系谱平均错误率约为11%，初芹等[2]评估了我国荷斯坦牛群体的系谱，发现中国荷斯坦牛群平均系谱错误率为16.62%。除奶牛外，系谱错误在其他畜种中也有研究报道。2014 年，张哲等[3]对某个杜洛克猪群体进行系谱分析，发现其系谱的错误率为6%。

错误的系谱信息会导致遗传评定准确性大大降低，减慢群体的遗传进展，比系谱缺失带来更大的育种损失[4]。同时，错误的系谱信息也会影响基因定位和基因组选择等其他利用系谱信息的研究可靠性。对地方畜禽保种群体而言，保种猪来源主要从不同个体养猪从业者搜集而来，难以得到准确的个体亲缘信息。另外，很多地方品种的系谱记录不完全、系谱信息错误多，甚至无系谱。不完整或错误的系谱信息会使群体近交系数过快增加，从而加速群体近交退化导致巨大的经济损失。

近年来，单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP）作为新一代分子标记，具有基因组覆盖度高、分布范围广、分型准确性高和成本低等特点，逐渐成为人类及动植物亲缘关系鉴定及遗传研究中最常用的分子标记。随着测序及生物芯片技术的进步，目前已有多种猪的商业化SNP 芯片陆续推出，使得从全基因组层面上研究地方猪种的遗传结构和系谱特征成为可能。

枣庄黑盖猪，俗称“盖子猪”，是在独特的地理气候条件、自然资源及人文环境下形成的地方猪遗传资源。从20 世纪80 年代开始，随着外来品种的引进，枣庄黑盖猪不断地被淘汰，养殖数量越来越少，一度处于濒危的边缘。2004年，在山东省畜牧兽医局、滕州市畜牧兽医局、山东省农科院畜牧兽医研究所和山东农业大学支持下，山东春藤食品有限公司对枣庄黑盖猪这一古老猪种资源进行保护性地发掘、繁育、提纯和复壮。2019 年3 月，枣庄黑盖猪通过国家畜禽遗传资源委员会遗传资源鉴定。本研究利用全基因组范围内高密度的SNP 标记，对枣庄黑盖猪核心群样本进行群体结构分析并构建家系，为该猪种的保护利用提供了分子水平的参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2018 年10 月在枣庄黑盖猪场采集样本，2018 年11 月份委托北京康普森生物技术有限公司进行SNP 基因型测定。2018 年底在山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室进行数据分析。

1.2 试验材料

枣庄黑盖猪核心群200 头公、母猪，用耳号钳剪取少许耳组织放入离心管中，加入75%酒精浸泡，-20 ℃保存以备基因组DNA 提取。

1.3 基因型测定

利用血液/ 组织/ 细胞基因组提取试剂盒（DP304，天根生化科技有限公司）提取待测样本基因组DNA，经Nanodrop（260/280在1.7 ～2.1 范围之间，浓度＞50 ng/ul）和琼脂糖凝胶电泳（条带清晰）检测合格后，委托北京康普森生物技术有限公司利用Illumina CAUPorcineSNP50 BeadChip 芯片进行基因组SNP 测定。

1.4 数据分析

1.4.1 SNP 质量控制

利用PLINK v1.90[5]按照以下标准进行质控：1）去除检出率小于0.95 的SNP 标记（命令：plink--file myfile--geno 0.05）；2）去除最小等位基因频率（Minor allele frequency, MAF）小于0.05（命令：plink--file myfile--maf 0.05）的SNP 标记。质量控制后剩余SNP 用于后续分析。

1.4.2 群体结构与亲缘关系分析

基于质控后的SNP 数据，利用PLINK v1.90[5]进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）（命令：plink--file myfile --pca 4），并利用R 软件绘制第一主成分与第二主成分的二维图。基于基因组同源相同（Identity-by-descent，IBD）信息，利用PLINK v1.90[5]（命令plink--file myfile--genome）评估枣庄黑盖猪群体个体对间亲缘系数及家系内个体对亲缘系数。

1.4.3 群体系统发生树分析和分子系谱划分

利用MEGA7 软件[6]，采用邻接法（Neighbour joining, NJ）绘制枣庄黑盖猪核心群样本的分子系统发生树。基于系统发生树，划分各个家系，构建分子系谱。

1.4.4 群体和家系的遗传多样性分析

利用PLINK v1.90[5]对枣庄黑盖猪整个群体和各个家系进行观察杂合度（Observed heterozygosity, HO）和期望杂合度（Expected heterozygosity, HE）（命令：plink--file myfile--hardy）等遗传多样性指标分析。

2 结果与分析

2.1 SNP 质量控制

研究采用Illumina CAUPorcin eSNP55 BeadChip 芯片，对枣庄黑盖猪基因组SNP 进行扫描分型，共检测出43 832 个SNP 位点。其中39 140 个SNP 通过质量控制可用于后续分析。质控后每条染色体的SNP 数目及SNP 间隔距离如图1所示。可以看出，不同染色体SNP间隔距离分布较为均衡，平均为66.23 kb。由于染色体长度差异，不同染色体SNP 数量变化较大，1 号染色体SNP 数目最多为4 646 个，18号染色体SNP数目最少为996个。

2.2 种群亲缘关系分析

首先利用质控后SNP 数据，对200 个样本进行主成分分析，初步了解枣庄黑盖猪群体遗传结构。图2 为根据主成分1 和主成分2 绘制的散点图。可以看出，枣庄黑盖猪样本在图中的分布很不均匀，其中第2 主成分中左侧的个体比较紧密，表明这些枣庄黑盖猪的亲缘关系较近。

利用基因组IBD 信息进一步评估枣庄黑盖猪样本全部个体对的亲缘系数。200 个样本可以形成19 900 个关系对，其平均亲缘系数为0.103 2。其中，85.84% 个体对亲缘关系较远（亲缘系数≤0.25），13.30%个体对亲缘关系较近（亲缘系数0.25 ～0.5），另有0.86%个体对亲缘关系很近（亲缘系数≥0.5），这些个体对之间交配极有可能使隐性不良基因纯合造成近交衰退。故对于这部分亲缘系数较大或很大的个体对，选配时需要格外注意避开。

2.3 系统进化树分析及家系构建

为研究枣庄黑盖猪样本的家系组成，基于芯片数据对枣庄黑盖猪进行群体分子系统发生树分析。图3 为采用NJ 法绘制的系统发生树，可以看出，枣庄黑盖猪在分子系统发生树上聚集成几个独立的大分支，这些分支可以作为家系划分的依据。另外，还有一些小分支，数量多，每个支内的样本数少，不作为单独家系划分。综合考虑系统发生树的分支和公猪分布，把枣庄黑盖猪分成了8 个家系，分别用红色、蓝色、浅绿色、黄色、紫色、灰色、黑色和墨绿色表示。

图1 质量控制后SNP 在各染色体上的数量及间隔距离

图2 枣庄黑盖猪种群的主成分分析结果

各家系样本量、遗传多样性、亲缘系数信息详见表1。家系样本量变化较大，家系3 样本量最大为38 个，家系1 样本量最小为18。由于家系划分时考虑了公猪的分布，公猪分配较均匀，有利于后期配种计划的制定。不同家系的遗传多样性变化较小，最大为0.358 5，最小为0.253 7。不同家系内个体对亲缘系数变化较大，其中，家系4 的亲缘系数最高（0.340 7），其次为家系1（0.323 6），这与两个家系样本量小，在系统发生树上聚集最为紧凑相一致；家系6 的亲缘系数最小（0.140 0），这与该家系由4 个相对独立分支组成有关。家系内个体对亲缘系数均明显大于整个群体的个体对亲缘系数（0.103 2），故为避免群体近交系数过快增长，制定配种计划时，应家系间个体交配，尽量避免同一家系内个体之间的交配。

3 结论

本研究利用基因组上39 140 个SNP 标记，对枣庄黑盖猪核心群进行了群体结构、亲缘系数、系统发生树等遗传分析及分子系谱构建，结果表明枣庄黑盖猪的亲缘关系分布很不均匀，部分个体对亲缘系数大，亲缘关系较近，在选配过程中，如不能避开这些个体之间的交配可能造成近交现象。枣庄黑盖猪在分子系统发生树上聚集成几个独立的分支，综合考虑系统发生树的分支和公猪分布，把枣庄黑盖猪分成了8 个家系，不同家系内个体对亲缘系数变化较大，但均明显大于群体的个体对亲缘系数。为避免群体近交系数过快增长，枣庄黑盖猪选配时，应尽量避免同一家系内个体之间的交配。