金刚藤颗粒对急性盆腔炎模型大鼠NLRP3炎症小体通路及免疫功能的影响*

2019-09-13邹学红

中国中医急症 2019年8期

邹学红汪俊王芳谢环

（湖北省武汉市汉阳医院，湖北武汉 433000）

急性盆腔炎（APID）是指女性内生殖器及盆腔腹膜等部位的炎症性疾病［1］，主要表现为慢性下腹痛、呕吐、恶心、月经紊乱等症状，且由于该病炎症扩展范围不同，患者临床表现并不完全一致［2］。APID炎症严重者可引发感染性休克、弥漫性腹膜炎等并发症。NLRP3炎症小体参与多种炎症反应，可促进白细胞介素-1β（IL-1β）前体转化为有活性的IL-1β，使其加重炎症反应。张强等研究报道NLRP3炎症小体在肾脏炎症损伤早期过程发挥重要作用［3］。研究报道，抑制NLRP3的表达，可减弱慢阻肺、心肌损伤等疾病中的炎症反应，但关于NLRP3在APID中的研究尚未见报道［4］。金刚藤颗粒具有解热清毒、抗菌消肿的作用，可用于盆腔炎等妇科疾病的治疗［5］。本研究采用金刚藤颗粒治疗APID大鼠，探究其对大鼠NLRP3炎症小体及免疫功能的影响，以期为临床治疗APID的机制提供更多的思路。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雌性SD大鼠105只由武汉大学动物实验中心提供，生产许可证号SCXK（鄂）2014-0004，使用许可证号SYXK（鄂）2014-0013，体质量200～220 g。按照实验动物饲养管理规定饲养，大鼠自由饮水，保持室内通风良好，光照时间为8∶00～20∶00，温度为18～28℃，湿度为40%～70%。

1.2 试药与仪器 1）试药。金刚藤颗粒购于广西润达制药股份有限公司，批号Z20030062；十二烷基硫酸钠（SDS）、蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液购于北京索莱宝科技有限公司；4%多聚甲醛、DEPC水购于江苏恒瑞医药有限公司；IL-1β，IL-18 ELISA试剂盒购于北京全式金生物有限公司；Anti-NLRP3、Anti-IL-1β、Anti-Caspase-1、Anti-ASC、Anti-β-Actin购于北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）购于上海容创生物科技有限公司；苏木素、伊红染液购于美国Sigma公司；BCA试剂盒购于上海经科化学科技有限公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购于美国Genecopoeia公司。2）仪器。低温离心机购于德国Heraeus公司；尼康SMZ745光学显微镜购于上海普赫生物科技有限公司；微量移液枪、离心机、匀浆机、酶标仪购于德国Eppendorf，GIS-500凝胶成像仪购于Miulab公司；超低温冰箱购于日本Sanyo公司；电泳仪购于赛多利斯科学仪器北京有限公司。

1.3 模型制备取15只大鼠作为对照组，不进行模型制备，其余90只大鼠制备APID模型［6］，50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，腹部剃毛、常规消毒，腹部正中切口3 cm，使用眼科手术器械打开腹腔，暴露子宫，4号头皮针在子宫分叉处右侧朝卵巢方向进针，缓慢匀速注入25%苯酚胶浆0.05 mL，对侧子宫不注射作自身对照，注射完毕后，分层关腹，消毒，消毒纱布覆盖。APID模型制备过程中未出现大鼠死亡情况。保留15只大鼠只进行开腹和关腹手术，不注射苯酚胶浆为假手术组。

1.4 分组与干预 APID大鼠按照随机数字表法随机分为模型组及金刚藤颗粒低、中、高剂量组（分别含原生药8.1 g/kg、40.5 g/kg、81.0 g/kg），阳性对照组（罗红霉素82.74 mg/kg），每组均15只。分组后对照组、假手术组、模型组灌胃生理盐水100 mL/kg，金刚藤颗粒溶解后灌胃治疗，每日1次，连续15 d。实验期间常规监测动物的精神状态、体质量。

1.5 标本采集与检测灌胃15 d后，次日清晨处死大鼠，打开腹腔，腹主动脉采血，取血3 mL，室温避光静置30 min，3 000 r/min离心15 min，分离血清置于-20℃冰箱中保存待测。1）ELISA检测大鼠血清IL-1β，IL-18水平。按照试剂盒说明书进行。2）大鼠病理形态学观察。打开腹腔，摘取双侧子宫，肉眼观察子宫色泽、弹性、化脓及周围组织是否粘连。观察完毕后将大鼠部分子宫组织置于-80℃冰箱保存，部分组织于4%多聚甲醛溶液中固定，子宫组织切成5 μm的切片，苏木精-伊红（HE）进行染色，显微镜下观察子宫组织的病理形态。3）实时定量PCR检测NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA表达水平。取冻存的各组织标本并按照Trizol试剂盒（Fermenas公司）说明书提取总RNA，将RNA反转录为cDNA并以其为模板进行实时定量PCR检测。反应体系为25 mL：SYBR GreenⅠqPCR Master Mix 12 mL，上下游引物各1 mL，cDNA模板1 mL，ddH2O 10 mL。其中引物合成见表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；48 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环。反应结束后收集数据，并对所得数据Ct值进行分析，以 GADPH 为内参基因，采用 2-ΔΔCt算法计算NLRP3、ASC、IL-1、Caspase-1 mRNA的相对表达量。引物信息见表1。4）Western blotting检测子宫组织NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表达水平：取出液氮中冻存的子宫组织剪切50～100 mg制备组织匀浆，蛋白裂解液反应30 min，提取总蛋白；BCA试剂盒测定蛋白浓度，SDS变性蛋白；SDS-PAGE电泳跑胶，蛋白上样量为20 μg，电泳结束后切除目的条带凝胶，目的蛋白凝胶转移到PVDF膜上，4℃进行转膜，转膜反应1 h，后用TBST清洗；5%脱脂奶封闭1 h，TBST洗3×5 min，一抗（NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1抗体，稀释倍数1∶1 000）4℃过夜，TBST洗3×5 min；IgG二抗（稀释倍数1∶5 000）室温孵育1h，TBST洗3×5 min；ECL显色液显色，凝胶成像仪观察蛋白表达情况，Image J进行目的条带的灰度光密度分析，以β-Actin为内参。

1.6 统计学处理应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（）表示，计量资料多组间对比采用单因素方差分析，两两对比采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物信息

2结果

2.1 各组大鼠子宫肉眼观察的比较对照组、假手术组大鼠行为、精神状态、饮食均正常，大鼠子宫大小、颜色、形态正常，触摸发现子宫硬度正常，浆膜面未见明显肿胀出血；模型组大鼠子宫末端膨大，管腔扩张迂曲，管壁变薄，管腔可见黄色脓液或者清凉液体，浆膜面明显肿胀、充血，盆腔脏器粘连充血；金刚藤颗粒各组子宫肿胀、充血减轻，阳性对照组与金刚藤颗粒高剂量组无显著差异。

2.2 各组大鼠子宫病理学比较见图1。HE染色结果显示，对照组、假手术组子宫内膜结构完整，模型组大鼠子宫内膜上皮细胞脱落坏死，腔壁结构紊乱，全层炎性细胞浸润，有充血水肿，符合APID临床病变。金刚藤颗粒治疗组、阳性对照组较模型组有显著改善，表明金刚藤颗粒对APID大鼠有良好的治疗效果。

图1 各组大鼠子宫病理学观察（HE染色，10倍）

2.3 各组大鼠血清IL-1β、IL-18水平比较见表2。ELISA检测显示，假手术组血清IL-1β、IL-18水平与对照组无显著差异，模型组血清IL-1β、IL-18水平显著高于假手术组（P＜0.05），金刚藤颗粒治疗组、阳性对照组IL-1β、IL-18水平较模型组显著降低（P＜0.05），且金刚藤高剂量组与阳性对照组无显著差异，与假手术组无显著差异（P＞0.05），表明金刚藤颗粒治疗效果显著。

表2 各组大鼠血清IL-1β、IL-18水平比较（pg/mL，±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，△P＜0.05；与模型组比较，◇P＜0.05；与金刚藤低剂量组比较，※P＜0.05；与金刚藤中剂量组比较，#P＜0.05。下同

组别对照组假手术组模型组金刚藤低剂量组金刚藤中剂量组金刚藤高剂量组阳性对照组n 15 15 15 15 15 15 15 IL-1β 16.23±4.02 16.41±3.98 8.26±9.55*△40.59±8.62*△◇30.18±7.22*△◇※19.13±6.16◇※#18.24±6.21◇※#IL-18 20.34±5.61 20.16±5.41 70.16±11.54*△53.16±9.64*△◇38.16±9.16*△◇※24.56±7.41◇※#23.21±7.26◇※#

2.4 各组大鼠子宫组织NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平比较见表3。mRNA检测显示，假手术组NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平与对照组无显著差异，以下均在假手术组的基础上进行比较，模型组NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平显著高于假手术组（P＜0.05），金刚藤颗粒治疗组、阳性对照组各指标水平较模型组显著降低（P＜0.05），且金刚藤颗粒高剂量组与阳性对照组无显著差异（P＞0.05）。

表3 各组大鼠子宫组织NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平比较（±s）

组别对照组假手术组模型组金刚藤低剂量组金刚藤中剂量组金刚藤高剂量组阳性对照组n 15 15 15 15 15 15 15 NLRP3 1.03±0.04 1.01±0.05 5.26±0.52△4.59±0.32△◇3.18±0.22△◇1.23±0.12△◇1.18±0.08△◇ASC 1.04±0.03 1.06±0.02 4.46±0.54△3.16±0.37△◇2.38±0.26△◇1.16±0.14△◇1.11±0.09△◇IL-1β 0.97±0.02 0.99±0.01 6.11±0.48△4.39±0.42△◇2.38±0.20△◇1.10±0.16△◇1.08±0.13△◇Caspase-1 1.03±0.03 1.06±0.04 3.76±0.44△2.56±0.31△◇2.09±0.21△◇1.16±0.13△◇1.14±0.11△◇

2.5 各组大鼠子宫组织NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平比较见图2，表4。蛋白检测显示，假手术组NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平与对照组无显著差异，模型组NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1水平显著高于假手术组（P＜0.05），金刚藤颗粒治疗组、阳性对照组各指标水平较模型组显著降低（P＜0.05）。

3讨论

图2 大鼠子宫组织NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白检测

表4 各组大鼠子宫组织NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平比较（±s）

组别对照组假手术组模型组金刚藤低剂量组金刚藤中剂量组金刚藤高剂量组阳性对照组n 15 15 15 15 15 15 15 NLRP3 0.23±0.04 0.25±0.05 0.84±0.05△0.57±0.03△◇0.39±0.04△◇0.33±0.05△◇0.31±0.07△◇ASC 0.34±0.03 0.26±0.03 0.91±0.04△0.76±0.05△◇0.58±0.04△◇0.46±0.05△◇0.41±0.04△◇IL-1β 0.17±0.02 0.19±0.05 0.81±0.03△0.69±0.04△◇0.60±0.05△◇0.51±0.07△◇0.46±0.03△◇Caspase-1 0.22±0.03 0.26±0.04 0.89±0.08△0.76±0.07△◇0.59±0.05△◇0.46±0.03△◇0.38±0.05△◇

近年来盆腔炎发病率逐年上升，严重影响女性的生活质量及身心健康。盆腔炎的发生多因为产后感染、盆腔周围炎症扩散等。APID多是由于致病微生物入侵生殖系统，引起生殖道及周围组织的炎症反应［7］。APID治疗前必须确定致病菌，再对症下药。目前治疗APID常使用抗生素，青霉素可治疗革兰氏阳性菌、敏感性葡萄球菌等，但容易引起抗药性；四环素主要针对衣原体、支原体感染［8］。虽然西医治疗效果良好，但易引起不良反应及抗药性，故本研究采用中药治疗APID大鼠，分析其治疗效果及作用机制。

本研究采用灌注25%苯酚胶浆制备APID大鼠模型，造模15 d后处死大鼠肉眼观察模型组大鼠子宫末端膨大，浆膜面明显肿胀、充血，HE染色模型组大鼠子宫内膜上皮细胞脱落坏死，腔壁结构紊乱，全层炎性细胞浸润，有充血水肿，表明APID大鼠造模成功。以往研究表明APID容易引起大鼠炎性浸润及内膜充血水肿［9］，进一步研究显示血清IL-1β、IL-18水平显著升高，表明大鼠出现严重的炎症反应。

APID在中医范畴属于带下痛经，可通过降低炎症感染的发生率来对症治疗［10］。金刚藤颗粒主要成分为金刚藤，其含有氨基酸、有机酸、皂基、生物碱等多种活性物质，具有活血化瘀、清热解毒之功效［11］。且金刚藤颗粒对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有较好的拮抗作用，可通过使用金刚藤颗粒起到抗感染的作用［12］。本研究显示与模型组比较金刚藤颗粒治疗组、阳性对照组大鼠子宫组织症状有一定改善，HE染色显示子宫内膜结构及炎症细胞浸润均得到改善，且IL-1β、IL-18水平降低，表明金刚藤颗粒能够降低大鼠炎症反应。

病原菌入侵机体后可被机体免疫系统的模式识别受体（PRR）识别出来，引起机体的固有免疫反应，进而介导炎症反应，引起组织器官的免疫损伤［13］。NOD样受体（NLR）是细胞内重要的PRR，NLRP是NLR的一个亚家族，可活化组装进而形成炎症小体，从而诱导 IL-1β、IL-18等促炎因子的释放［14］。炎症小体由NLR、接头蛋白ASC、效应蛋白Caspase-1组成［15］。研究报道NLRP3炎症小体可诱导无活性的IL-1β、IL-18的基因转录，促进炎症因子的分泌；其还可通过NLRP3-ASC-Caspase-1炎症小体诱导Caspase-1的活化，进而促进IL-1β的活化［16-17］。研究报道，心肌损伤组织中NLRP3炎症小体通路大量激活［18］。NLRP3炎症小体在全身炎性反应综合征中参与肺组织损伤［19］。烫伤小鼠心肌组织中NLRP3炎症小体通路大量激活，抑制NLRP3炎症小体通路，可明显减轻心肌损伤［20］。本研究中APID模型组NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1表达高于对照组，金刚藤颗粒治疗后NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1显著降低，表明NLRP3炎症小体通路与APID损伤相关，金刚藤颗粒可能通过抑制NLRP3炎症小体通路发挥保护作用。

综上所述，金刚藤颗粒对APID大鼠炎症损伤具有一定的保护作用，其可能通过NLRP3炎症小体通路抑制炎症反应，本研究为APID的治疗提供一定的理论参考，但具体作用机制有待进一步研究。