莲白片的质量标准研究

邹 丽 ，马 静 ，2

（1.四川省食品药品检验检测院，四川 成都 611731； 2.电子科技大学，四川 成都 611731）

莲白片是由穿心莲、白花蛇舌草、石上柏等5味药材制成的薄膜衣片，具有抗癌、散结、止痛、止血等作用，临床常用于绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、肺癌、鼻炎癌等，与放射治疗或化学治疗配合使用可缩短疗程，加快肿瘤消退。穿心莲为方中君药，具有清热解毒、凉血消肿功效，主要成分为内酯类、黄酮类和甾醇类等[1]。穿心莲内酯具有显著的抗炎消肿作用，在穿心莲定量分析成分中占有比率较高，可作为本品含量测定的检测指标[2-3]。白花蛇舌草为方中臣药，具有清热解毒、消痛散结功效，具有明显的抗肿瘤活性[4]，主要成分为黄酮类、有机酸类、甾醇类、多糖类等[5-6]，其中齐墩果酸的含量较高，鉴别斑点明显，也常作为白花蛇舌草鉴别的对照品。穿心莲、白花蛇舌草、石上柏等均含有黄酮类成分，其化学性质稳定，具有抗肿瘤和抗氧化自由基等活性作用，与莲白片的药理功效关系密切。本研究中建立白莲片含量测定方法时将总黄酮作为检测指标。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

KQ400KDE型台式高功率数控清洗器（功率为40～100 W，工作频率为40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9625A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；全自动薄层铺板仪（北京思普特科技有限公司）；LB-2D型智能崩解时限测定仪（上海黄海药检仪器销售有限公司）；XP205DR型电子天平（十万分之一，Mettler Toledo公司）；LC-20AD型高效液相泵，SPD-20A型紫外检测器（日本岛津公司），美国奥泰SS420X工作站；市售硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）；自制硅胶G薄层板（取硅胶G适量，按1份固定相和3份含0.3%羧甲基纤维素钠的水溶液进行混匀，用薄层铺板器制成 10 cm×20 cm、厚度 0.4 mm的硅胶 G薄层板，晾干，110℃条件下加热30 min，置干燥器存放）。

1.2 试药

乙醇、乙酸乙酯、正己烷、三氯甲烷、冰醋酸、磷钼酸、三氯化铝、醋酸钠等(分析纯，成都市方舟化学试剂厂)；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；纯净水（娃哈哈集团有限公司）；齐墩果酸对照品（批号为110709-201206），芦丁对照品（批号为100080-201610），穿心莲内酯对照品（供鉴别用，批号为110797-201609），白花蛇舌草对照药材（供鉴别用，批号为121183-201605），均购于中国食品药品检定研究院；莲白片（实验室自制，批号分别为 20170103，20170104，20170105）。

2 方法与结果

2.1 白花蛇舌草薄层色谱鉴别

取本品适量，去薄膜衣，研细，取2 g，精密称定，加甲醇20 mL，超声处理 40 min，滤过，滤液浓缩至 1 mL，作为供试品溶液。取齐墩果酸对照品适量，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液；另取白花蛇舌草对照药材1 g，照供试品溶液制备方法同法制备对照药材溶液。取莲白片处方中除白花蛇舌草外的药材，通过相应制备工艺制成阴性对照品，取约2 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。参照2015年版《中国药典（一部）》[7]通则0502项下方法，精密吸取对照品溶液5 μL、供试品溶液及阴性对照品溶液各 10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇（5∶5∶1，V／V／V）为展开剂，上行展开 15 min，取出，晾干，喷10%磷钼酸乙醇试液，在105℃ 下加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液及对照药材溶液相同位置上显相同颜色斑点，Rf值0.3～0.7，斑点分离度良好，阴性对照无干扰。详见图1。

图1 白花蛇舌草薄层色谱图

检视条件考察时，展开后，分别喷2%三氯化铁试液或10%磷钼酸乙醇试液加热至斑点显色清晰后于日光下检视。结果最佳检视条件为后者。薄层板选择时，分别在市售硅胶G薄层板和自制硅胶G薄层板上点样并依法展开，结果两者的特征斑点均显色清晰，分离度达到要求。

2.2 崩解时限考察

分别取3批样品各6片，参照2015年版《中国药典（四部）》[7]通则0921崩解时限中的方法，在盐酸溶液（9→1 000）中进行崩解时限考察。结果表明，3批样品均于1 h内全部崩解，符合相关规定。

2.3 总黄酮含量测定

2.3.1 溶液制备

取105℃减压干燥至恒重的芦丁对照品11.67 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（每1 mL中含芦丁1.167 mg）。取莲白片适量，去包衣，取约3 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷70 mL，回流3 h脱脂，滤过，弃去三氯甲烷，残渣挥干，加甲醇70 mL，再加热回流2 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。称取1.5 g无水醋酸钠，加入50 mL水使溶解，用冰醋酸调节 pH至4.5 ±0.1，得醋酸 -醋酸钠缓冲液（pH ＝4.5 ±0.1），备用。称取0.68 g三氯化铝，加入50 mL乙醇使溶解，得三氯化铝溶液 0.102 mol／L（0.1 mol／L），备用。

2.3.2 最大吸收波长确定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1 mL，分别置10 mL容量瓶中，依次加入0.1 mol／L三氯化铝溶液 1 mL 和 pH（4.5±0.1）醋酸 -醋酸钠缓冲液 1 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀，放置30 min。取续滤液置比色皿中，照紫外-可见分光光度法[2015年版《中国药典》通则0401][7]，在200～800 nm波长范围内扫描。结果上述溶液在415 nm波长处均有最大吸收，故以此为测定波长。光谱图见图2。

图2 紫外可见分光光谱图

2.3.3 方法学考察

专属性试验：按莲白片的处方配制缺总黄酮的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液，进行全波长（200～800 nm）扫描测定。结果阴性对照品溶液在415 nm波长处基本无吸收，表明处方中其他成分对总黄酮测定无干扰。

标准曲线考察：精密量取质量浓度为1.167 g／L的对照品溶液 0，0.10，0.25，0.50，0.80，1.00，1.20 mL，分别置7个10 mL容量瓶中，依次加入0.102 mol／L三氯化铝溶液 1 mL和 pH(4.5±0.1)醋酸 -醋酸钠缓冲液1 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀，放置 30 min。按紫外 -可见分光光度法（2015年版《中国药典》通则0401），以第1管作为空白对照，415 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（Y）、质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程 Y＝0.014 8 X＋0.153 2，r＝0.999 2（n ＝6）。结果表明，总黄酮质量浓度在 11.67 ～140.04 μg／mL范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：精密量取质量浓度为1.167 g／L的对照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，依法显色后测定吸光度。结果芦丁对照品吸光度的 RSD为0.42%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，依法显色，分别在室温下每隔20 min测定吸光度。结果吸光度 RSD为0.87%（n＝6），表明供试品溶液在120 min内稳定性较高。

重复性试验：取样品（批号为20170103）适量，依法制备供试品溶液，照上述显色方法测定吸光度。结果总黄酮的平均含量为 1.947 mg，RSD 为 1.74% （n＝6），表明方法重复性较好。

加样回收试验：精密称取已知含量的莲白片（批号为20170103）6份，分别加入质量浓度为6.82 g／L的芦丁对照品溶液各1 mL，依法制备供试品溶液，照上述显色方法测定吸光度，并计算回收率。结果见表1。

表1 总黄酮加样回收试验结果（n＝6）

2.3.4 样品含量测定

取实验室自制3批样品，依法制备供试品溶液，照上述显色方法测定吸光度，从标准曲线上求出供试品溶液中总黄酮的含量。结果见表2。

2.4 穿心莲内酯含量测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -水（45 ∶55，V／V）；流速：1 mL ／min；柱温：35 ℃；紫外检测波长：225 nm；进样量：10 μL。

表2 样品含量测定结果（mg，n＝3）

2.4.2 溶液制备

取穿心莲内酯对照品 11.62 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为1.162 g／L的对照品贮备液；精密量取上述贮备液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为0.116 2 g／L的对照品溶液；精密量取对照品溶液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为 58.1 μg／mL的对照品溶液。取本品适量，去包衣，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，取出放冷，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得供试品溶液。取莲白片处方中除穿心莲外的其他药材，按制备工艺和供试品制备方法，同法制成阴性对照品溶液。

2.4.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.4.2项下3种溶液各适量，按拟订色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图(见图3)。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液相同保留时间有相关峰出现，阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。

线性关系考察：精密吸取质量浓度为 58.1 μg／mL和 1.162 g／L 的对照品溶液各 2，5，10 μL，注入高效液相色谱仪，以绝对进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝2 245.1 X-116 134，r＝0.999 8（n＝6）。结果表明，穿心莲内酯进样量在0.116～11.62 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取质量浓度为 58.1 μg／mL的对照品溶液10 μL，依法进样。结果，穿心莲内酯峰面积的 RSD为0.95%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品适量，按拟订方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别于 0，2，4，8，12 h 时测定。结果的RSD为1.27%(n＝5)，表明供试品溶液在12 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品（批号为20170103），依法制备供试品溶液并测定，计算含量。结果穿心莲内酯平均含量为每片 0.383 mg，RSD 为 1.53% （n ＝6），表明方法重复性良好。

图3 高效液相色谱图

加样回收试验：取已知含量（批号为20170103，含量为每片 0.191 mg）样品 6份，去包衣后研成细粉，各1 g，置 6个具塞锥形瓶中，每份加入质量浓度为1.624 g／L的对照品溶液1 mL，依法制备供试品溶液按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

2.4.4 样品含量测定

取3批自制样品适量（每批平行取2份），依法制备供试品溶液，精密吸取质量浓度为58.1 μg／mL穿心莲对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪测定，并计算含量。结果见表2。

3 讨论

3.1 薄层色谱条件

点样量选择时，吸取对照品溶液、供试品溶液各2，5，10，20 μL，点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，依法展开，按斑点清晰度和分离度选择，结果最佳点样量为供试品溶液10 μL、对照品溶液5 μL。展开剂选择时，分别以乙酸乙酯 -甲醇 -水（8∶1∶1，V／V／V）[8]、三氯甲烷 -乙醚（5∶l）[9]、甲苯 -丙酮 -乙酸（10∶2∶0.2，V／V／V）[10]和正己烷 -三氯甲烷 -甲醇（5∶5∶1，V／V／V）为展开剂展开并显色。结果采用前3种展开剂时特征斑点出现了分离度不好、拖尾严重、Rf值过高的情况；而最后1种展开剂的斑点分离度较好，斑点颜色清晰，Rf值适中。故以正己烷-三氯甲烷-甲醇（5∶5∶1，V／V／V）为展开剂。

3.2 总黄酮含量测定

提取溶剂：一般提取黄酮类成分时，常采用30%乙醇、乙醇[11]、60%乙醇[12]为提取溶剂，但本试验中考察发现，采用低浓度乙醇提取的总黄酮不完全、水溶性杂质多；而用乙醇提取总黄酮的水溶性杂质虽少，但含有部分脂溶性杂质。综合考虑，莲白片采用三氯甲烷脱脂除杂，再以甲醇为提取溶剂，可充分提取总黄酮。

提取方法及时间：分别直接采用超声波提取1 h、加热回流提取3 h、索氏连续回流提取2 h，结果前两者的总黄酮含量较低，提取不完全，提取效率较低；而采用后一种方法提取，总黄酮含量高，提取时间充分，适合作为莲白片的提取方法。

比色方法：分别采用硝酸铝显色法[13]和三氯化铝显色法[14]对莲白片中总黄酮进行测定。使用硝酸铝显色法时，芦丁对照品溶液于500 nm波长处有最大吸收，而供试品溶液于500 nm波长处的吸收较弱，说明莲白片用此方法测定的专属性不强，有一定局限性。而采用三氯化铝显色法的专属性较强，在415 nm波长处的干扰小，适合测定莲白片中的总黄酮。另外，还考察过显色时间，从加入显色剂开始，每隔5 min测1次吸光度，结果在加入显色剂后25～35 min时，吸光度值变化缓慢，无显著差异，故确定最后的显色时间为30 min；三氯化铝的用量，分别加入了 0.1 mol／L三氯化铝溶液 0.5，1.0，1.5 mL，同法制成供试品溶液，结果随着显色剂用量的增大，吸光度先增大后缩小，用量在1.0 mL时吸光度最大。

3.3 穿心莲内酯含量测定

前处理考察：分别以甲醇[15]、40%甲醇[16]和60%甲醇溶液为提取溶剂；用超声波提取和加热回流提取为提取方法；以提取15，30，60 min为提取时间对穿心莲内酯的前处理方法进行考察。结果表明，在不同提取溶剂、提取方法及提取时间的条件下，供试品溶液中均有与穿心莲内酯对照品溶液保留时间一致的峰，但综合有效成分的含量、分离度、出峰时间及峰宽等因素考虑，最终选择以60%甲醇为提取溶剂、超声提取30 min。

系统耐用性试验：分别考察了不同品牌的色谱柱[Shim-pack C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），Diamonsil C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）]，不同柱温（25，30，35℃），不同的流动相条件[甲醇-水梯度洗脱[17]、甲醇-水（65 ∶35，V／V）[18]和甲醇 -水（45 ∶55，V／V）]的差异。结果表明，在不同品牌的色谱柱、不同比例的流动相及不同柱温条件下，供试品溶液中均有与穿心莲内酯对照品保留时间一致的峰，说明该色谱条件的系统适用性良好；但从出峰时间、分离度、理论板数、基线波动、试验效率等因素的影响来考虑，发现流动相为甲醇-水（45∶55，V／V）时，穿心莲内酯与其他组分的分离度达到要求[分离度(R)≥1.5]，色谱峰峰形对称而尖锐[拖尾因子(T)为 1.01]，故确定流动相为甲醇-水（45∶55，V／V），柱温为 35℃。