疼痛应答中背根神经节可变剪接的鉴定与分析

邓秀玲 王海生 叶纪诚 张建宇 孙计桃 苑红

慢性疼痛是临床上常见的神经病理与主观感受症状[1]，其形成和调控机制极具复杂性，目前各种治疗效果都不理想，因此对于慢性疼痛的发病机制及药物治疗的研究仍然是人们关注的焦点和难点[2]。脊髓背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）作为联系外周传入纤维和脊髓的纽带，其神经元胞体能合成参与传递疼痛信息的各种神经递质和调质[3-4]，一直都是慢性疼痛发病机制及其治疗的研究热点。本实验采用完全佛氏佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA）诱导绵羊产生炎性疼痛，研究基于绵羊疼痛应答过程中DRG 的RNA-seq 测序数据，通过Tophat 软件分析鉴定炎性疼痛发生时DRG 内可变剪接事件和差异剪接基因（DSG），通过GO 分析这些DSG 的功能，从而在转录水平揭示大型动物对慢性疼痛应答的分子机制，为深入研究疼痛产生机制提供思路和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取6 只绵羊，体重30 kg 左右，年龄2 岁龄，由内蒙古生物制造重点实验室羊场提供。适应性喂养1 周后，随机分为实验组和对照组，每组3 只。实验组采用足底掌部按50 uL/kg 皮下注射CFA，建立炎性疼痛模型；对照组不建立疼痛模型。对照组3 只绵羊依次命名为：c1、c2、c3；实验组3 只绵羊依次命名为：t1、t2、t3。屠宰后分别采集 6 只绵羊的背根神经节组织立即保存于液氮中。

1.2 RNA 的提取和质量检测

采用TRIzol 法提取绵羊DRG 组织总RNA，利用BioRad 的分光光度计来判断RNA 的纯度，OD260/OD280 比值大于1.8，则说明制备的RNA 纯度较好，无蛋白质及小分子污染。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。

1.3 RNA-seq 数据测序、比对与组装

RNA-seq 测序由武汉生命之美科技有限公司完成，采用Illumina HiSeq 2000 进行RNA 测序，将测序得到的原始数据过滤，去除低质量、污染序列和接头后，得到clean reads，从数据库中下载绵羊的参考基因组及相关注释文件（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Ovis_aries/）然后采用Tophat 软件将上述过滤得到的clean reads 与绵羊的基因组序列进行比对，再用Cufflinks 软件对读段进行组装和注释。

1.4 可变剪接事件分析与鉴定

使用Tophat 软件对实验组和对照组每个样品存在的可变剪接位点及剪接方式进行整体分析和归类分析。根据P≤0.05，T ＞0 的为上调，T ＜0 的为下调，来寻找AS 差异表达的基因。使用DAVID 在线软件对差异剪接基因进行功能富集分析，采用P＜0.05作为显著富集标准。

2 结果

2.1 两组绵羊一般情况

实验组绵羊经CFA 诱导后，在注射部位观察到局部出现红、肿等炎性症状，并表现出踮脚、陂行及不能站立等功能异常，对照着组绵羊无炎性表现，行动自如。

2.2 可变剪接方式位点分析

RNA-seq 原始数据经过质控后，每个样品均产生不低于5 GB的clean data，GC 含量平均为85.9%且Q30 ＞44.1%，测序数据满足后续分析。通过Tophat 软件将clean data 比对到绵羊参考基因组上，6 个样品70%～84%的clean reads 能比对到绵羊的参考基因组上。将经过Cufflinks 软件组装的转录本与绵羊参考基因组进行比较，对照组鉴定出可变剪接事件为8 527 个，实验组鉴定出可变剪接事件为6 212 个，其中已注释的可变剪接由1 321 下降为959 个，新的可变剪接数目由7 206 下降为5 253 个；可变剪接事件归类分析显示IR 事件为最多的可变剪接事件，约占29.3%，其次为A3SS、A5SS 和ES（见表1）。

2.3 可变剪接差异基因鉴定

各个样本剔除重复后，实验组与对照组相比，共得到360 条AS 差异表达基因，117 条上调，243 条下调，见表2。差异剪接基因中IR 事件的所占比最高，在上调基因中约占48.7%，下调基因中约占34.2%。结果显示，发生AS 差异表达的基因更倾向于在疼痛应答过程中，DRG 基因以gene model 的形式表达或者不发生可变剪接事件。

2.4 差异剪接基因的功能富集分析

对获得的差异剪接基因进行GO 富集分析，可变剪接最显著的10 类GO 分析生物过程显示，这些差异基因主要富集在电压门控离子通道、钠离子结合和钠离子运输相关基因及钙离子通道及离子运输相关基因、调控Ras-GTP 酶活性和Ras 蛋白信号转导功能上等过程中（图1）。其中HCN，CLCN3，KCNC4，CACNA2D1，TRPC4，CACNA2D1，ACAP2，GIT2，TRIO 基 因 的可变剪接模式存在显著差异。

表1 可变剪接事件类型及基因数（个）

表2 实验组与对照组比较AS 差异表达基因数（个）

图1 差异表达基因最显著的前10 类GO 分析过程

3 讨论

可变剪接是真核基因转录后调控和蛋白质多样性的重要机制，RNA-seq 可以准确检测基因的表达量，精确地识别基因序列变化，被广泛应用于鉴定和分析动植物基因组中发生的可变剪接事件[5]。可变剪接的失调会导致人类各种疾病的发生，如：癌症、早衰症、强直性营养不良等[6-7]，它已成为真核基因调控领域的研究热点。但目前关于可变剪接与疼痛发生、发展的相关研究鲜为少见。因此，本研究通过RNA-seq 技术鉴定绵羊DRG 组织发生的可变剪接事件，对照组鉴定出可变剪接事件为8 527 个，实验组鉴定出可变剪接事件为6 212 个，暗示绵羊疼痛应答倾向于减少可变剪接事件的发生，这可能是绵羊在可变剪接调控水平对疼痛应答的机制之一。本研究中发现了大量的新可变剪接事件，其中IntronR 事件为最多的可变剪接事件，其次为A3SS、A5SS 和ES。可变剪接模式存在显著差异的基因主要富集在钾、钠、钙离子通道、调控RasGTP酶活性和Ras 蛋白信号转导功能中。其中HCN，CLCN3，KCNC4，CACNA2D1，TRPC4，CACNA2D1，ACAP2，GIT2，TRIO 基因的可变剪接模式存在较为显著的差异。RasGTPase 是重要的信号传导蛋白，有研究发现该蛋白在神经轴突的生长、导向和分枝中发挥重要功能，而且与神经性疼痛相关[8]，本研究发现该类基因的可变剪接在疼痛响应中受可变剪接调控。近年来有学者[9-11]采用DNA 芯片和生物信息的方法，筛选外周神经损伤后DGR神经元基因表达变化，得到了大量的调控基因。Chengyu Yin[12]等采用RNA-seq 技术对疼痛综合征小鼠DRG 内转录本进行测序，鉴定了295 个差异表达的基因，其中上调基因195 个，下调基因100 个。本研究发现，电压门控离子通道相关基因发生可变剪接模式的差异表达，暗示绵羊中电压门控离子通道相关基因可能通过可变剪接模式的改变来参与疼痛应答，这将为炎性疼痛在转录水平的调控机制研究提供新思路，本实验筛选出了可变剪接具有差异的基因，可为后续研究提供方向。