基于电子鼻和分光测色仪技术的茶树叶片氮营养诊断

2019-09-12傅嘉敏王梦荷张丽霞黄晓琴韩晓阳

植物营养与肥料学报 2019年8期

傅嘉敏，耿琦，王梦荷，张丽霞，黄晓琴，韩晓阳*

（l 山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018；2 作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）

茶树是叶用型经济作物，耗氮量较高。缺氮茶树不仅生长缓慢、叶片变黄、产量降低[1]，而且茶叶香气低、不耐冲泡、滋味较苦涩[2]，因此缺氮会对茶树生长及茶叶品质产生负面影响。快速进行茶树氮营养诊断是茶树科学施肥的重要前提。已有植物氮素营养诊断方法主要包括植株外部形态诊断、植株全氮诊断、植株硝酸盐诊断[3-4]。这些方法操作过程复杂，消耗的人力物力多，且缺乏时效性。随着检测新技术的不断出现，无损诊断技术逐渐被应用到氮素诊断中，如叶绿素仪法、叶绿素荧光技术[5]、遥感技术等[6]。

植物叶片内均含有一定量的挥发性物质，其产生与植物的种类和栽培管理有直接关联。一般而言，茶树鲜叶中含有的挥发性物质种类较成品茶少，大多属于低沸点、低分子量的烷烃、醇、醛及萜类化合物等物质。在茶树生长发育过程中，氮可直接或间接影响鲜叶内游离香气的组成和含量。因此，茶树鲜叶的气味物质组分及含量，可反映茶树的氮营养状况。同时，茶树在缺氮下叶片呈现不同程度的黄化现象，从而引起叶片表面颜色的变化，因此也可以利用颜色对茶树叶片缺氮状况进行评价。电子鼻是一种模拟人类嗅觉系统的人工智能电子仪器，可以用来测量一种或多种物质的气体敏感系统，被广泛应用于肉类[7]、酒类[8]的品质评价和苹果[9]、梨[10]、茶叶[11]等农产品品质评价的研究。分光测色仪具有检测速度快、精度高、适合在实验室环境及生产环境中离线操作等优点，利于实际应用推广。通过电子鼻与分光测色仪来检测茶树叶片的气味和颜色，能够更加全面快速地反映叶片的缺氮程度。但目前尚无将电子鼻与分光测色仪相结合来识别茶树叶片氮含量的报道。

本文以电子鼻和分光测色仪检测技术为基础，研究气味和颜色与茶树叶片氮含量的关系，通过提取反映气味与颜色的特征参数，建立基于气味与颜色的氮含量预测模型，从而确立一种茶树叶片氮含量简便易行的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试茶树叶片来自山东省泰安市东兴农业有限公司茶园。将茶树叶片按叶色分为黄色 (Y)、黄绿色(YG)、绿色 (G)、深绿色 (DG) 四个等级 (图 1)。试验所用样品为茶树顶芽向下第3～4片无损伤叶片。取样后立即送回实验室进行测定。

1.2 电子鼻系统及检测参数优化

图 1 不同等级茶树叶片Fig. 1 Color of tea leaf in different grades

试验以绿色 (G) 等级的茶树鲜叶为研究对象进行电子鼻参数优化。20片叶为一个试验样本 (课题组前期预备试验发现，20片叶所得结果最佳，过多过少都会降低检测的准确性)，样本质量控制在 (5.0 ± 1.0) g。采摘后立刻将茶叶样品放入盛有吸水纸和Na2CO3(烘干后使用) 的三角瓶中用锡箔纸封口，采用顶空吸气法利用PEN3型便携式仿生电子鼻系统 (PEN3，Airsense Analytics GmbH，Germany) 进行气体检测分析，PEN3具有十个金属氧化物传感器，如表1所示。

本试验主要优化因子为气体收集器体积、顶空预热温度、顶空时间。气体收集瓶体积试验设50、100、150 mL 3个处理；顶空预热温度试验设30、40、50、60、70、80℃ 6个处理；顶空时间试验设5、10、15、20、25、30 min 6个处理。每组有20次重复。

电子鼻检测参数为传感器清洗时间100 s，自动调零时间10 s，样品准备时间5 s，样品测定间隔时间1 s，内部流量300 mL/min，进样流量300 mL/min，将80～83 s处的信号作为传感器信号分析的时间点。每次测量前后，传感器进行清洗和标准化。

1.3 茶树叶片色度检测

本试验使用美能达CM-5分光色差仪对茶树叶片色度值进行测定。样品的测量部位是叶肉区，每组20次重复。色度值主要包括L、a、b值。L表示黑白或者亮暗，+为偏白或亮，-为偏黑或暗；a表示红绿，+为偏红，-为偏绿；b表示黄蓝，+为偏黄，-为偏蓝。

1.4 茶叶叶片总氮含量测定

用凯氏定氮法[12]测定茶叶总氮含量。称磨细烘干的茶叶样品 (过0.25～0.50 mm筛) 0.4 g。然后加入浓硫酸，置于消化炉上进行消化，最后得到消化液。取消化液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加入5 mL 40% NaOH溶液和5 mL含有混合指示剂的硼酸溶液进行蒸馏。用0.025 mol/L H2SO4标准液对蒸馏液进行测定。

1.5 数据的提取、处理及模型建立

1.5.1 电子鼻传感器数据特征值的提取电子鼻传感器响应值表示方法：Ri= G/G0。式中，Ri为第i个传感器输入的信号比值；G为传感器接触到样品挥发物后的电阻量 (Ω)；G0为传感器在零气 (经过标准活性碳过滤后的气体) 中的电阻量 (Ω)。

1.5.2 数据处理采用电子鼻自带Winmuster软件将经过优化后的传感器响应特征值进行主成分分析(principal component analysis，PCA)、线性判别法分析 (linear discriminant analysis，LDA) 和负荷加载分析 (loadings analysis，LA)。采用Origin 8.0软件对测色仪L、a、b值分别进行一元线性回归分析 (one variant linear regression analysis)。利用SPSS 16.0软件采用LSD法进行单因素方差分析 (one-way Anova)，并进行t检验。

表1 PEN3型电子鼻传感器性能Table 1 Sensor sensitivities of the PEN3 e-nose

1.5.3 模型的建立及验证每个等级叶片选择50个样本用于建立模型。另外随机选择30个样本对所建模型进行验证测试。采用SPSS 16.0软件建立气味—氮含量、颜色—氮含量、气味颜色—氮含量线性回归模型。通过模型的预测值与实际测定值对比，验证预测模型的准确性。

2 结果与分析

2.1 电子鼻传感器优化

由于10个传感器所侧重检测的气体成分不同，因此电子鼻传感器对茶树叶片气味物质的响应存在差异。由图2-a、b、c可见，在顶空时间、气体收集器的容积、顶空预热温度三个优化参数中，S2、S6、S7、S8、S9五个传感器的响应值发生了较大的变化。在顶空时间参数中，传感器S2、S6、S7、S8、S9的响应值变化范围分别为2.84～8.40、2.29～3.33、3.48～9.34、1.42～1.87、2.64～5.85。在气体收集器容积参数中，传感器S2、S6、S7、S8、S9的响应值变化范围分别为2.74～2.94、2.31～2.64、3.20～3.49、1.47～1.56、2.67～2.80。在顶空温度参数中，传感器S2、S6、S7、S8、S9的响应值变化范围分别为2.94～12.15、2.51～6.23、3.48～13.35、1.56～2.92、2.78～8.76。从三个参数中的响应值来看，S2、S7、S9大于S6、S8。此外，S1、S3、S4、S5、S10 五个传感器响应值均在1.0左右，表明这些传感器对气体物质的响应不敏感。

过载分析通常用来考察传感器对模型PCA数据空间分布的影响，据此可判定模型中传感器区分能力的大小。通常传感器坐标值离原点 (0，0) 越远，传感器区分样品的能力越大。由图2d可知，对叶片气味识别能力最大的传感器为S6，其次为S9、S7、S2、S8，其他传感器没有明显的识别能力。叶片挥发物气体的主要成分为甲烷、有机硫化物、无机硫化物、氮氧化合物和醇类、醛类、酮类。依据表1中各传感器的敏感成分，选择S2、S6、S7、S8、S9为后续试验主要传感器。

2.2 前处理优化

电子鼻传感器响应信号除受到外界环境及自身特性的影响外，还受到气体收集容器内压强及挥发性物质浓度的影响，因此，收集容器的大小直接影响传感器的信号识别。PCA分析可见，50、100、150 mL气体收集容器的气味位点两两重叠 (图3 a-1)，LDA分析发现，容器体积为100 mL和150 mL处理的气味位点有重叠，而50 mL处理的气味位点较为集中，区分明显 (图3 a-2)。因此，试验选取50 mL为最终气体收集器体积。

由不同PCA分析来看，顶空预热温度为30℃的气味位点比较集中，而50、60、70、80℃处理气味位点群内离散程度大 (图3 b-1)。LDA数据分析可见，30℃和40℃的气味位点可以清楚区分开。但当温度升高后处理间出现重叠区域 (图3 b-2)。总体来看，温度较低时，样品气味位点较为集中，无重叠区域，且区分明显。因此，基于PCA和LDA数据分析，顶空预热温度最终选择为30℃。

由图3 c-1和c-2数据分析来看，30 min处理样品点数据离散程度小，并且与其他处理无重叠，其它几组处理都有重叠区域。因此，试验最终选取顶空时间为30 min。

2.3 茶树鲜叶的电子鼻检测

取80～83s时间点的气味响应值数据进行PCA和LDA分析 (图4)。在PCA分析中第1主成分和第2主成分总的贡献率为99.37%。黄绿色叶片 (YG) 分析结果与黄色 (Y)、绿色 (G) 和深绿色 (DG) 叶片有小部分重叠，说明在一定程度上利用PCA分析法可将不同氮素含量的茶树叶片用电子鼻进行区分。由LDA分析可知，2个判别因子累计贡献率82.89%，DG能够与其它处理区分开，但距离较近，表明不同氮素含量的茶树叶片所挥发的气体组分存在一定的相似性。

2.4 茶树叶片色度检测

随氮素缺乏程度的加重，茶树叶片表面颜色从绿色逐渐变成黄色。图5表明，色度值参数的选择影响色度值与叶片氮含量的相关性。在Lab表色系统中，+b表示黄色，+b值越大表示所测样品黄色程度越重。本试验中b值 (表示黄蓝) 均大于0，与总氮含量呈现线性相关，且其决定系数为0.9204，说明b值与叶片黄化有极显著的相关性。L值 (黑白)与叶片总氮含量的线性相关性最低，a值 (红绿) 虽然呈现出一定的线性，但决定系数低于b值。因此，b值可以作为判断叶片氮含量的一个标志 (图5)。

2.5 叶片氮含量预测模型的建立

2.5.1 建模因子的单因素方差分析优化后的电子鼻传感器S2、S6、S7、S8、S9和测色仪b值与茶树叶片氮含量的P值均小于0.05，表明各因子与氮含量存在极显著的相关性，可以利用表2中因子进行建模。

图 2 10个传感器对不同优化条件下样品的响应值曲线及过载分析Fig. 2 Response curve and loading analysis of 10 different sensors for samples under different optimized conditions

图 3 电子鼻80～83 s时间点气味数据的主成分分析 (PCA) 及线性判别分析 (LDA)Fig. 3 PCA and LDA analysis of odor intensity data by electronic nose at 80-83 s

图 4 PCA和LDA方法分析的四类颜色叶片电子鼻气味响应值的分布Fig. 4 Odor intensity distribution of the four colors of fresh tea leaves by electric nose based on PCA and LDA

图 5 茶树叶片氮素含量与L、a、b值线性回归Fig. 5 Linear regression of nitrogen contents of tea leaves with L, a and b values

2.5.2 三种叶片氮含量预测模型的建立 1) 基于气味的叶片氮含量预测模型，即选取响应值较大的S2、S6、S7、S8、S9号传感器响应值 (R2、R6、R7、R8、R9) 对不同氮含量叶片建立预测模型。基于气味的茶树叶片氮含量 (Y) 预测模型为：Y =216.496 - 109.843R2 - 41.831R6 + 0.205R7 -17.857R8 - 43.696R9。由表3模型Ⅰ可见，P值小于0.05，表明该模型线性相关显著。

2) 基于颜色的叶片氮含量预测模型，即将b值与叶片氮含量相结合建立预测模型。基于颜色的不同氮素含量叶片判别模型为：Y = 5.052 - 0.058b。将b值带入上式，得出的Y值即判为该叶片氮素含量。由表3中模型Ⅱ可见，P值小于0.05，说明该模型具有显著性。

3) 基于气味、颜色的叶片氮含量预测模型，即基于气味结合颜色两个测定值的茶树叶片氮素含量预测模型为：Y = 29.663 - 17.207R2 + 7.843R6 -9.117R7 + 1.853R8 - 7.894R9 - 0.061b。将响应值R2、R6、R7、R8、R9、b值带入上式，得出的Y值即判为该叶片氮素含量。由表3中模型Ⅲ可见，P值小于0.05，说明该模型具有显著性。

表2 传感器及色差值对茶树叶片氮含量的方差分析Table 2 Anova analysis of nitrogen contents of tea leaves by sensors and chromatic aberration value

表3 三种预测模型的方差分析Table 3 Anova analysis of three prediction models

2.5.3 预测模型验证三种模型分别利用30个样本氮素含量的预测值和实测值的差异验证模型的准确率 (表4)。模型Ⅰ和模型Ⅱ中各有6个样本的预测值与测定值相差较大，模型准确率均为80%。模型Ⅲ中有3个样本的预测值与测定值相差较大，模型准确率为90%。通过比较以上3种叶片氮素含量预测模型的准确率可以看出，气味结合颜色建立的模型准确率最高。因此，气味结合颜色的预测模型较优。

3 讨论

电子鼻作为一种非常有潜力的鉴别工具，在食品、农产品检测领域得到广泛应用。电子鼻中不同传感器对样品的识别贡献率存在着较大的差异。殷勇等[13]基于响应信号的积分值、平均微分值、相对稳态平均值的表征变量对传感器进行了筛选，从而减少了信息冗余及计算复杂度，最终对霉变玉米最低鉴别正确率均在96%以上。唐琳等[14]确定了反映脊尾白虾新鲜度变化的5个气敏传感器，通过传感器数据建立的预测模型准确率可达92%以上。可见传感器的筛选对于电子鼻对样品的识别度有极为重要的意义。本试验首先优化了电子鼻的10个传感器，确定了S2、S6、S7、S8、S9 作为最终的传感器，以此建立了可以预测茶树叶片氮含量的模型，预测准确率可达到80%。

气敏传感器的响应受到挥发性物质的成分、浓度和压强的影响，其中浓度和压强则在电子鼻取样的过程中，是可能随时间变化的。本试验50 mL处理相对于100 mL、150 mL处理样点能够清晰区分，其原因可能是容器容积越大，顶空生成时间内所形成的顶空气体浓度越低，电子鼻传感器对气味的敏感度降低。而50 mL容器体积能够在顶空时间内聚集浓度较高的气体挥发物，瓶内压强较大，有利于传感器对气体挥发物的捕捉检测。其次，在试验中顶空预热温度的不同，电子鼻传感器灵敏度也存在差异。传感器对30℃和40℃的样品区分效果较好。虽然预热温度较低，收集器中挥发性物质成分的浓度降低，但同时水汽含量减少，削弱了水汽对传感器敏感性的影响。当样品温度升高 (50℃～80℃)，水汽成分增大，虽然试验中添加了吸收水分的设置，但在一定程度上掩盖了不同组分间在挥发性物质成分上的差异，极大地影响了某些传感器的敏感性，造成样品的组内离差变大，组间离差变小。此外，本试验还发现顶空生成时间较长的样品 (顶空30 min)，其区分度较高，这也与顶空生成时间的增加使样品气体挥发物的浓度增高，有利于电子鼻传感器对挥发物的区分识别有关。

茶树鲜叶中挥发性芳香物质的种类及含量对于成品茶香气的最后形成意义重大。一般而言，茶树鲜叶中挥发性香气物质较成品茶少，大约有80余种[15]，大多属于低沸点、低分子量的香气物质，如反-2-庚烯醛、顺-3-己烯-1-醇、己醇等[16-17]。这些化合物为植物叶片提供“绿叶”、“青草”或“新鲜植物”味[18]。氮素不仅可以影响茶叶的产量和质量，还可影响挥发性化合物关键前体的合成[19-20]。因此，合理的施氮量均有利于香气成分的合成[21]。过少或不施氮则影响前体物向芳香成分的转化，导致芳香物质含量低[16,22-23]。因此，通过对气体挥发物的测定来预测氮素含量是可行的。本试验发现呈现一定缺氮程度的叶片不能被电子鼻显著区分开，其原因可能是叶片的主要挥发性物质比较相近，传感器无法识别Y、YG、G处理三者共有香气组分的差异，从而导致LDA分析中有部分重合。因此，下一步我们将用多特征融合模式更有效地表征电子鼻对茶树叶片的响应信息，有利于提高鉴别的正确率。