竹醋液壳聚糖复合涂膜对椪柑保鲜效果的研究

陈 艺，黎 琴，吴亚倩，刘 红，胡尚连，赵 博

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳621010）

椪柑（Citrus reticulata cv.Ponkan）是我国主要的柑橘类水果之一，果实皮薄易剥、色泽鲜美、组织紧密、浓甜脆嫩，深受大众喜爱。椪柑果实在采后容易受青霉病、绿霉病等真菌性病害的侵染而腐烂变质，难以贮藏。目前国内主要利用化学保鲜剂来对椪柑进行防腐保鲜［1］。但长期使用化学保鲜剂，不但会使微生物产生抗药性而导致保鲜效果下降，而且污染环境，严重影响人们的身体健康。因此，寻求安全、无毒、高效的天然产物保鲜剂成为新的研究热点［2］。

壳聚糖又名脱乙酰甲壳素，是几丁质的脱乙酰衍生物［3］，具有良好的成膜性。壳聚糖由于含有游离氨基［4］，与微生物细胞膜表面带负电的物质相互作用，可使细胞内营养物质发生泄漏死亡。此外壳聚糖能在微生物表面形成致密的膜，阻止微生物的呼吸及营养物质的转运［5］，对细菌、真菌等微生物具有抑制作用，从而可以降低果实贮藏期间的腐烂率［6-7］，有效提高果实的保鲜效果［8-10］。竹醋液是竹材在热解或干馏的过程中产生的烟气经冷凝得到的具有多种化学成分的棕褐色液体［11］，带有天然熏香味。它含有200多种有机成分以及数10种矿物质，主要成分为水、有机酸、酚类、酮类、醇类［12］，是一种纯天然、绿色环保的新产品。研究表明：竹醋液有良好的抑菌效果［13］，如对大肠杆菌［14］、金黄色葡萄球菌［15］、苹果炭疽病病菌［16］有较好的抑制作用，是一种很有潜力的天然果蔬保鲜剂。

根据实验室前期研究发现，虽然壳聚糖和竹醋液均有一定的抑菌效果，但是各自的能够抑制的微生物范围相对较窄，单独作为果蔬保鲜剂使用效果较差。鉴于此，研究将对柑橘类果实危害最大的绿霉病病原菌-指状青霉（Penicillium digitatum）作为对象菌，研究壳聚糖和竹醋液各自的抑菌效力，并将二者复配成复合保鲜剂，研究其对椪柑果实的保鲜效果，以期为椪柑的贮藏保鲜提供一条新的途径，同时为竹醋液这种竹加工产物提供一条有效的利用途径。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：恒温培养振荡箱（金坛市精达仪器制造有限公司）；超速离心机（Eppendorf公司）；电导率仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）；恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司）；电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；紫外分光光度计（上海昂拉仪器有限公司）；超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；高压灭菌锅（三洋电机株式会社）；红外线二氧化碳分析仪（北京华云分析仪器有限公司）；手持折光仪（浙江力辰仪器科技有限公司）。

试剂与样品：竹醋液（浙江义乌宝泰家居用品有限公司）；壳聚糖（山东汇益生物科技有限公司）；指状青霉病菌（中国农业微生物菌种保藏管理中心）；2，6-二氯酚靛酚钠盐、PVPP、PVP、聚乙二醇6000（PEG6000）、聚乙二醇单辛基苯基醚（TritonX-100）、邻苯二甲酸氢钾、硫代巴比妥酸、无水醋酸钠、愈创木酚（阿拉丁试剂）；98%浓硫酸、冰醋酸、氢氧化钠、草酸、酚酞、抗坏血酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、碳酸氢钠、亚硫酸钠、30%过氧化氢溶液、乙醇（国药集团化学试剂成都有限公司）。

试验材料：椪柑采摘于学校附近一管理良好的果园，当日运回西南科技大学生命科学与工程学院实验室。挑选果形均匀，无病虫害、成熟度一致的椪柑果实于室温预贮2 d后进行保鲜处理。

1.2 方法

1.2.1 指状青霉菌菌种的活化 在无菌环境下，用接种环挑取指状青霉菌白色菌丝少许，接种于制备好的PDA培养基上，置于28℃恒温箱中，培养一周后，即得活化的指状青霉菌菌种。

在当代插画创作中，编织也是艺术家喜欢使用的工艺技法。毛毡材料和编织物的组合比单一的竹子或是其他天然材料更为夺目，尤其是它们颜色的碰撞和质地的反差，使最终作品更加耀眼。其次，毛毡材料独特的整体成型特性可以使作品更加立体，并带来视觉上的升华。此外，毛毡材料柔软且令人愉悦，带来亲肤感，并且不会使观众感觉到抵触。

1.2.2 孢子悬浮液的制备 在无菌环境下，在培养基内加入少量无菌水，将孢子刮下，置于已灭菌的含有玻璃球的三角瓶内，充分振荡后用无菌脱脂棉过滤，制成孢子悬浮液。

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1.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定 将制备好的指状青霉菌菌饼接种在含有不同浓度抑菌液的液体培养基试管中，以不加竹醋液和壳聚糖的试管为对照组。28℃恒温培养后连续观察1周，以试管内完全无菌丝生长的最小浓度为抑菌液对指状青霉菌的最小抑菌浓度。

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（2）病果率：

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（1）失重率：采用称量法测定，从每组随机选取若干果实首先称量处理前的质量，然后每隔5 d分别称量，并通过下式计算果实失重率。

要想防止和解决物流企业财务风险，就必须做好建立、健全企业内部财务控制机制体系的有效措施。物流企业财务内部监控工作建立在企业各项资金预算的基础上，并且符合企业运作的整体利益。企业在充分运用实时财务信息的条件下，应该及时监督和控制公司整体经营目标进展情况。同时，企业需要加强对资金流量加以监控，其目的为确保企业经营目标实现的情况下提升资金使用的效率。

（4）可溶性固形物：采用手持折光仪测定，每次测定重复3次；

1.2.4 椪柑果实的保鲜处理 选择大小、色泽均匀的果实作为试验用果。将果实分为4组，分别用蒸馏水（CK）、1.5%竹醋液（T1）、1%壳聚糖溶液（T2）以及竹醋液壳聚糖复配液（T3）（竹醋液含量1.5%，壳聚糖含量1%）浸泡1 min，蒸馏水浸泡的作为对照，处理完成后，将果实摊开自然风干，置于室温下贮藏，每隔5 d取样检测各项指标。

病果率（%）＝（每个处理中腐烂果数／每个处理中果实总数）×100

以上（5）（6）（7）的测定均参照曹建康等［18］的方法进行。

式中S为失重率（%）；m1为果实质量差（g）；m2为果实质量（g）。

（5）可滴定酸：采用酸碱中和法测定（结果以柠檬酸的量换算），每次测定重复3次；

（6）Vc含量：采用2，6-二氯酚靛酚滴定法测定，每次测定重复3次；

煤炭资源的开采除了会对人体、土地、空气产生严重的破坏以外，对水资源的污染也极为严重。在煤炭开采的过程中会产生两种形式的废水。一种为矿井水，另一种则为洗煤水。无论是哪一种水，其中都含有大量的悬浮物、酸性物质以及放射性物质。与此同时，矿井水和洗煤水还会影响周围浅层的地下水水质、人与动植物一旦食用，后果可想而知。洗煤水不仅仅是煤炭清洗过后的脏水，它其中还含有洗煤过程中倒入的一些化学药品。含有这种化学药品的洗煤水一经外流就会不断的渗入地下，久而久之就会使得饮用水的质量下降，而产生一系列不良的影响。

耕地是人类赖以生存的基本条件，是农业生产的基础，而且土地资源本身具备一定的环境修复功能，对地球表层的生态系统改造有很大影响。中国是农业大国，但是耕地总面积较少，加上近年来城市化、工业化发展，导致一部分耕地资源逐渐变为建设用地，加大了粮食安全生产压力。

（7）MDA含量：利用紫外分光光度计测定吸光度值，再根据公式，计算得出。

（3）呼吸强度：采用红外线CO2分析仪［17］测定；

1.3 数据统计与分析

全部数据采用Origin 8.5整理及绘图；运用SPSS 22.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 竹醋液与壳聚糖的最小抑菌浓度（MIC）

椪柑果实在采收、运输以及贮藏的过程中特别容易受到指状青霉菌的侵染而腐烂。通过测定竹醋液及壳聚糖对以指状青霉菌的MIC来确定椪柑保鲜剂的浓度配比。竹醋液及壳聚糖对指状青霉菌的MIC见表1。竹醋液对指状青霉菌的MIC为1.5%，壳聚糖对指状青霉菌的MIC为0.8%。关于竹醋液对指状青霉菌的抑制效果，试验结果仅代表研究中所选用的竹醋液，因为竹醋液的成份是随着制备竹醋液的竹材的品种和制备工艺的不同而变化的。

表1 竹醋液和壳聚糖对指状青霉菌的最小抑菌浓度Tab.1 Minimum inhibitory concentration of bamboo vinegar and chitosan on Penicillium digitatum

由表1可以看出，无论是竹醋液还是壳聚糖，当浓度达到一定程度的时候，都可以抑制指状青霉菌的生长，这说明二者可以在一定程度上预防柑橘类果实的绿霉病。为了探究将竹醋液和壳聚糖复配使用的效果，在前期研究的基础上，选用1%浓度的壳聚糖溶液做为成膜剂，然后在其中添加竹醋原液，使竹醋液浓度为1.5%（竹醋液浓度过高会导致保鲜剂有较大烟熏味，影响果实商品价值，因此选择可以抑菌的最低浓度）。将二者复配后作为椪柑保鲜剂使用，并且和单独使用二者做比较。

2.1.2 二阶导数光谱 采用Perkin Elmer公司的Spectrum软件中的求导功能，选择13点平滑，获得二阶导数光谱图。

1.2.5 柑果实测定指标及方法

2.2 竹醋液壳聚糖复合保鲜剂对椪柑果实失重率和病果率的影响

果实的失重率是判断保鲜效果的重要指标之一。经不同处理的椪柑果实失重率如图1所示。由图可见所有处理和对照组果实的失重率均随着贮藏时间的延长而增加，这主要是由于果实自身的蒸腾作用和呼吸消耗导致果实的重量不断下降。通过对比发现：T2处理组的果实失重率与CK相比差异不明显（P＞0.05），而T1和T3 2个处理组的失重率明显低于CK（P＜0.05）。这可能是由于T1和T3 2个处理中有壳聚糖存在，在果实表面形成了一层膜，从而抑制了果实的蒸腾作用。到贮藏的后期，T3处理组的失重率是最低的。

从表2可以看出，在贮藏的前11 d各处理组均没有出现病果。CK组从第16 d开始出现病果，到第31 d时病果率为7.5%，是所有组中最高的。而T1、T2和T3各组处理均能不同程度的推迟出现病果的时间。单独使用壳聚糖（T1）和竹醋液（T2），可以不同程度的抑制果实的腐烂，贮藏至31 d时，T1和T2组的果实腐烂率均低于CK。而将壳聚糖和竹醋液复配后使用（T3），直到贮藏第31 d才出现病果，并且到最后该组病果率最低，只有0.6%。这说明竹醋液和壳聚糖复配使用可以明显降低果实病果率，其效果优于二者单独使用。

表2 不同处理对椪柑果实病果率的影响Tab.2 Effect of different treatments on the infection rate of Citrus reticulata cv.Ponkan fruit

2.3 竹醋液壳聚糖复合保鲜剂对椪柑果实呼吸强度的影响

呼吸作用是果蔬采后新陈代谢的最主要过程，通过呼吸作用将自身贮存的有机物氧化分解成自身生理活动所必需的能量和物质原料。但呼吸作用过强，果蔬自身的营养物质会很快被消耗，从而影响果蔬的商品价值。因此在贮藏过程中应尽量控制果实的呼吸作用，使其处于正常范围的最低水平，以延长果实贮藏期。由图5可知，对照组和各处理组果实的呼吸强度在贮藏期间均呈下降趋势，说明椪柑属于典型的非呼吸跃变型果实。其中竹醋液处理组（T2）果实的呼吸强度和对照相比差异不显著（P＞0.05），说明竹醋液处理对果实呼吸强度的影响不大。而T1和T3 2个处理组果实的呼吸强度在整个贮藏期间明显低于CK和T2，差异显著（P＜0.05）。这可能是壳聚糖涂膜处理在果实表面形成的膜延缓了果实和外界的气体交换，从而抑制了呼吸作用。

图1 不同处理对椪柑果实失重率的影响Fig.1 Effect of different treatments on weight loss rate of Citrus reticulata cv.Ponkan fruit

图2 不同处理对椪柑果实呼吸强度的影响Fig.2 Effect of different treatments on respiratory intensity of Citrus reticulata cv.Ponkan fruit

2.4 竹醋液壳聚糖复合保鲜剂对椪柑品质的影响

可溶性固形物主要包括可溶性糖类，还有少量有机酸、维生素、矿物质等。从图3可以看出，所有组的椪柑在贮藏期间，可溶性固形物含量都呈先上升后下降的趋势，其原因可能是果实在贮藏前期，果实内多糖的水解速度大于果实呼吸消耗，使单糖含量增加。在贮藏后期，呼吸消耗过程占优，导致可溶性固形物含量下降。到贮藏的中后期（21～31 d），3个处理组果实的可溶性固形物含量均高于对照组。其中T3处理组效果最好，与CK相比，差异显著（P＜0.05）。这说明竹醋液和壳聚糖复配使用，有利于果实维持较高的可溶性固形物含量，其效果优于竹醋液和壳聚糖单独使用。

图3 不同处理对椪柑果实品质指标变化的影响Fig.3 Effect of different treatment on quality indicators of Citrus reticulata cv.Ponkan fruit

Vc又名抗坏血酸，是一种普遍存在于水果蔬菜中的水溶性维生素，是椪柑果实的主要营养物质之一。从图3可看出，椪柑在贮藏期间，各组果实的Vc含量均呈下降趋势。总体而言，3个处理组的果实的Vc含量在贮藏的中后期（11-31 d）明显高于CK，差异显著（P＜0.05）。但是各个处理组之间的Vc含量在整个贮藏期间差异不明显（P＞0.05）。

可滴定酸是果实采后进行呼吸作用的主要底物之一，其含量直接影响果实风味品质。因此，在果实的采后贮藏过程中，如何有效延缓可滴定酸的降解则显得尤为重要。由图3可看出，随着贮藏时间的延长，各处理组的可滴定酸含量均呈下降趋势，这与万春鹏等的研究结果一致［19］。在整个贮藏期间，3个处理组果实的可滴定酸含量均高于CK，差异显著（P＜0.05）。其中处理T3效果最好，说明竹醋液＋壳聚糖复合涂膜处理能有效延缓果实可滴定酸含量的下降，保持果实良好营养品质。

2.5 竹醋液壳聚糖复合保鲜剂对椪柑果实丙二醛含量和过氧化物酶活性的影响

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化作用最主要的产物之一。一般来说，MDA含量越低，说明果实受到的伤害越小，其保鲜效果越好。由图4可以看出，椪柑的MDA含量随着贮藏时间的延长而增加，这与邓利珍等的研究结果一致［20］。到了贮藏的中后期（21-31 d），3个处理组果实的MDA含量均低于CK，差异显著（P＜0.05）。其中处理T3的MDA含量最低，与其它各组相比差异显著（P＜0.05）。这说明竹醋液和壳聚糖复合涂膜可以有效的抑制椪柑果实的膜脂过氧化作用，其效果优于二者单独使用。

图4 不同处理对椪柑果实丙二醛含量和过氧化物酶活性的影响Fig.4 Effect of different treatments on malondialdehyde content and peroxidase activity of Citrus reticulata cv.Ponkan fruit

过氧化物酶（POD）是果实体内清除活性氧自由基的重要保护酶，对维持活性氧、自由基代谢平衡具有重要作用。POD活性水平较高，表明果实清除活性氧能力强，有利于椪柑果实贮藏。如图4所示，各个处理组和CK的POD活性在整个贮藏期间呈现先上升后下降的趋势。其中T1和T3 2个处理组的POD活性明显高于T1和CK，差异显著（P＜0.05）。特别是T3处理组的POD活性是所有处理中最高的，说明竹醋液和壳聚糖复合涂膜促进椪柑果实POD活性升高，使其维持较高水平，有利于果实的贮藏保鲜。

3 结论与讨论

研究表明，竹醋液和壳聚糖对指状青霉菌均有抑制作用。将二者结合使用可以降低椪柑果实在贮藏期间的病果率和失重率，并且效果优于二者单独使用。其原因可能是竹醋液和壳聚糖相结合可以有效抑制以指状青霉菌为主的一系列柑橘采后病原微生物的活动，从而抑制了椪柑果实的腐烂。此外，由于壳聚糖在果实表面形成了薄膜，可以有效抑制果实体内水分的蒸发，因此降低了果实的失重率。果实采收离开母体后是活体组织，依然在进行各种新陈代谢活动。果实体内贮存的可溶性固形物、可滴定酸等物质可以作为呼吸底物被不断消耗，Vc等不断的被氧化，所以到了贮藏的中后期这些物质含量会不断下降。此外果实在采后贮藏过程中，组织逐渐衰老，细胞内会大量积累活性氧自由基等物质，使得细胞发生膜脂过氧化，POD是果实体内清除超氧阴离子和过氧化物的重要保护酶。研究的结果表明：竹醋液和壳聚糖复合涂膜能有效的抑制椪柑果实采后的呼吸作用以及体内营养物质的消耗，有效降低MDA含量，较好的保持果实中POD的活性，且效果优于二者单独使用。本次研究证明竹醋液对危害柑橘类果实的主要病原微生物-指状青霉菌具有很好的抑制作用，在壳聚糖的配合下，对椪柑果实防腐保鲜效果良好。竹醋液是一种来源于竹子的天然物质，与化学防腐保鲜剂相比，具有来源广泛、对环境无污染、操作简单等优点。将来有望用于柑橘类果实的贮藏保鲜。我国是世界上的主要产竹国之一，每年有大量的竹醋液产生，研究也为竹醋液的应用开辟了一条新的途径。