滁菊的耐缺氧保护机制依赖HIF-1和TnT

陈容前,汤 雷,汪玉玲,刘均涛,陈 岩,杨如江

(滁州城市职业学院医学系,安徽滁州 239000)

无论是平原还是高原缺氧暴露人群其患血栓性疾病的风险都是增加的[1-2],缺氧会增强血小板的反应性,促进血小板聚集及血栓形成[3]。近年来,尽管缺氧暴露的人群越来越多,但人们似乎仍缺乏对缺氧相关血栓性疾病风险的防范意识[4],因此,积极干预缺氧暴露风险具有重要的现实意义。目前,抗氧化干预可通过调节应激相关基因而发挥抗缺氧保护作用[5],抗氧化剂的摄入可提高机体缺氧耐受力[6]。滁菊多糖能提高小鼠缺氧耐受力的结果已经被证实,但滁菊多糖的耐缺氧保护作用是否与抗凝有关仍未知[7]。有报道称,滁菊对血流动力学具有改善功能[8],滁菊总黄酮则对心肌梗死小鼠心脏具有保护作用[9],提示滁菊的耐缺氧保护机制可能涉及抗凝及降低血栓性疾病风险。为验证这一猜想,本研究将探讨滁菊总提取物的耐缺氧保护功能与栓塞性死亡风险之间的关联性。

缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一种缺氧敏感基因,其与机体缺氧耐受潜能有关。有报道称,生活在高原地区极耐缺氧的拉达克牛,其基因微阵列检测结果显示HIF-1是最活跃的上调基因之一,HIF-1及其调节葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和己糖激酶(hexokinase,HK2)在牛的高原耐氧适应中扮演着重要角色[10-11],此外,HIF-1的基因上调对于高原缺氧暴露人群耐受力的提高是至关重要的,HIF-1信号抑制则在高原缺氧、水土不服发病机制中十分关键[12]。

脂蛋白a(lipoprotein a,Lp-a)是一种富含胆固醇的LDL样颗粒,其与缺血性心脏病、动脉粥样硬化、血栓形成和中风风险增加显著相关[13]。流行病学和遗传学研究已确定,血清Lp-a水平升高是心血管疾病的一个独立危险因素,Lp-a可能通过促动脉粥样硬化和血栓形成机制来增加心血管疾病风险[14]。为降低血栓形成及心血管疾病的风险,Lp-a靶向疗法应运而生[15]。

肌钙蛋白是心肌损伤的高度敏感的生物标志物,其水平升高被认为是心肌梗塞诊断的基石[16]。血清肌钙蛋白T(troponin T,TnT)是心脏病患者全因和心血管死亡率的良好预测因子,同时也是急性缺血中风死亡率的强预测因子[17]。

本研究将基于耐缺氧实验法建立小鼠氧气剥夺模型,考察滁菊干预对各风险因素的影响,以明确滁菊在提高缺氧耐受及预防缺氧诱导的栓塞性疾病风险的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级雄性ICR小鼠(20±2) g 南京市江宁区动物繁殖场;饲料及垫料 江苏省协同医药生物工程有限责任公司;钠石灰 东莞永胜宏基医疗器械有限公司;无水乙醇(分析纯) 天津市永大化学试剂有限公司;滁菊 安徽菊泰滁菊草本科技有限公司;2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH,D9132-5G) Sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;parafilm封口膜 上海碧云天生物技术有限公司;小鼠肌钙蛋白T(TnT)Elisa试剂盒、小鼠脂蛋白a(Lp-a)Elisa试剂盒、小鼠缺氧诱导因子-1(HIF-1)Elisa试剂盒 南京金益柏生物科技有限公司。

BSM-220.4型电子分析天平 上海卓精电子科技有限公司;DYQC型医用超声波清洗器 连云港欧倍洁医疗设备有限公司;帝肯sunrise梯度滤光片光吸收酶标仪 帝肯上海贸易有限公司;SHB-3A循环水多用真空泵 郑州杜甫仪器厂;离心机 无锡市瑞江分析仪器有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅 金坛区西城新瑞仪器厂;砂芯过滤装置 盐城市钰杨玻璃仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 滁菊溶液制备 称取1 g滁菊放入100 mL试管中,倒入70%乙醇40 mL,封口膜封好试管口后置于试管架上,放入超声波清洗器,功率设为192 W、温度为60 ℃,超声波提取10 min,提取液抽滤后将得到的滤液倒入蒸发皿,随后置于通风橱柜中的水浴锅上70 ℃蒸发得到提取物。纯净水溶解后于50 mL容量瓶定容制得实验用提取液备用。采用DPPH自由基清除法[18]检测提取物的抗氧化活力以控制每次提取液质量,DPPH自由基清除率控制在87%。

1.2.2 滁菊对小鼠缺氧暴露的干预 将18只ICR雄性小鼠随机分成2组,缺氧组和滁菊组,每组9只。缺氧组给予0.4 mL纯净水灌胃;滁菊组给予0.4 mL滁菊提取液(浓度为87%的DPPH自由基清除率)灌胃。预处理1 h后,将所有小鼠分别放入盛有200 g钠石灰的500 mL广口瓶中,盖实瓶盖后用封口膜密封缺氧处理30 min后使小鼠迅速脱离缺氧环境,第2 d、第3 d再重复两次,末次缺氧30 min后将小鼠取出,迅速眼球摘除法取血。具体实验流程见图1。

图1 滁菊干预缺氧暴露小鼠流程Fig.1 Protocol of pretreatment with Chuju in mice exposed to hypoxia

1.2.3 耐受鼠及敏感模型鼠建立 实验动物适应饲养一周后按体重随机分组,动物饲养环境为:温度(21±2) ℃,湿度(30%～70%),光照周期12 h/12 h,动物自由采食和饮水。实验期间,将选定的18只ICR雄性小鼠直接置于盛有钠石灰的广口瓶中,封口后立即记时,直至小鼠出现缺氧抽搐症状,迅速取出小鼠使其脱离缺氧环境,并记录每只小鼠的抽搐时间。根据抽搐时间,将小鼠分成缺氧敏感组(30 min以下)、中度敏感组(30～40 min)、耐受组(40 min以上)。其中,缺氧敏感组及耐受组小鼠在初次缺氧暴露后24 h、48 h再进行缺氧暴露2次,每次持续时间为25 min,末次缺氧后将所有小鼠取出眼球摘除法采血备用。

1.2.4 Elisa法检测血清HIF-1、Lp-a及TnT的含量

1.2.4.1 血清的制备 眼球摘除法采血后,置于10 mL离心管中,室温血液自然凝固10～20 min后,离心机3000 r/min下离心20 min。仔细收集上清置于EP管中并标签后,-20 ℃保存备用。保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

1.2.4.2 Elisa法实验操作 按小鼠HIF-1、Lp-a及TnT Elisa分析(enzyme linked immunoassay)试剂盒说明书进行实验操作,酶标仪450 nm波长下测定各孔的吸光度(OD值),根据标准曲线的回归方程及样本的OD值计算各样品的实际浓度。

1.3 统计处理

统计结果均采用平均数±标准差(±SD)来表示,运用SPSS 22.0 for windows软件进行One-way ANOVA:LSD-t检验进行组间差异比较,以p<0.05判定有无统计学差异。所有作图均由Origin 8.0软件实现。

2 结果与分析

2.1 HIF-1、Lp-a及TnT标准曲线的绘制

以标准品的OD值为横坐标(X),浓度为纵坐标(Y),进行曲线拟合。标准曲线的回归方程见图2,各回归方程的R2均在0.98以上,表明OD值与各指标浓度间存在显著的线性关系,即标准曲线拟合结果可靠。

图2 HIF-1、Lp-a及TnT标准曲线Fig.2 Standard curve of HIF-1,Lp-a and TnT

2.2 滁菊干预对缺氧鼠血清HIF-1、Lp-a、TnT的影响

耐缺氧动物实验已经证实滁菊可提高小鼠的缺氧耐受力[7],而HIF-1为缺氧耐受因子,为明确滁菊活性成分是否通过HIF-1提高缺氧鼠的缺氧耐受力,图3A显示了滁菊干预对缺氧小鼠血清HIF-1表达水平的影响。与单独缺氧暴露小鼠相比,缺氧前给予滁菊干预能极显著地提高HIF-1的表达水平(p<0.01),表明滁菊可促进缺氧状态下小鼠HIF-1的表达。

Lp-a及TnT是血栓性疾病的风险因子,为明确滁菊是否可抑制缺氧诱导的血栓性疾病风险,图3B、3C比较了缺氧暴露小鼠与滁菊干预小鼠之间血清Lp-a、TnT表达水平的差异。滁菊干预能显著地抑制缺氧鼠Lp-a及TnT的表达(p<0.05),表明滁菊可抑制缺氧诱导的血栓性疾病风险因子的表达。

图3 滁菊干预对缺氧暴露小鼠血清 HIF-1、Lp-a、TnT的影响(n=3)Fig.3 Effect of Chuju intervention on serum HIF-1,Lp-a, TnT in mice exposed to hypoxia(n=3)注:*代表差异显著,p<0.05;**代表 差异极显著,p<0.01,图4同。

2.3 缺氧耐受小鼠及缺氧敏感小鼠血清HIF-1、Lp-a、TnT表达差异

为明确滁菊对缺氧鼠HIF-1的上调是否发挥了抗缺氧保护功效,图4A比较了缺氧敏感鼠及耐受鼠血清中HIF-1表达水平差异。与缺氧敏感组小鼠相比,缺氧耐受组小鼠血清中缺氧诱导因子(HIF)显著增加(p<0.05),这与缺氧耐受动物HIF-1水平升高结果一致[9]。表明血清HIF-1表达水平升高有助于促进小鼠的缺氧耐受力,HIF-1上调介导了滁菊的耐缺氧保护机制。

为明确滁菊对缺氧诱导的血栓性疾病风险因子表达抑制是否参与了其抗缺氧保护机制,图4B、4C比较了缺氧敏感鼠及耐受鼠血清中Lp-a、TnT表达水平的差异。与缺氧敏感组小鼠相比,缺氧耐受组小鼠血清中Lp-a虽无统计学差异(p>0.05),但TnT表达水平则极显著降低(p<0.01),表明TnT为缺氧敏感因子,其表达下调有利于提高缺氧耐受力。因此,TnT的表达抑制参与了滁菊的耐缺氧保护机制。

图4 缺氧耐受组、敏感组小鼠血清中 HIF-1、Lp-a、TnT水平差异(n=3)Fig.4 Differences in serum levels of HIF-1, Lp-a,TnT between hypoxia-tolerant group and sensitive group(n=3)

3 讨论

HIF-1是一种缺氧应答因子,其本质为转录因子,其表达可启动下游一系列抗氧化应激因子的表达,从而促进缺氧适应[11,19]。图3A结果显示,与缺氧对照组相比,滁菊干预能极显著促进HIF-1的表达(p<0.01),提示HIF-1可能参与了滁菊的缺氧保护机制。与缺氧敏感鼠相比,缺氧耐受鼠的血清HIF-1水平显著增加(p<0.05)(图4A),这与缺氧耐受动物HIF-1水平升高的报道结果一致[10],说明HIF-1有利于缺氧动物耐受力的提高,滁菊可通过促进HIF-1表达而提高小鼠缺氧耐受力,即HIF-1的上调介导了滁菊的耐缺氧保护机制。

高原缺氧暴露人群中风的风险是增加的,尤其是缺血性中风最常见[2],随着高原缺氧暴露人群越来越多,研究高原中风风险具有十分重要的意义。临床研究表明,血清Lp-a水平升高是脑中风独立的死亡风险因子,Lp-a是心血管疾病的重要靶点[15]。滁菊干预能显著抑制缺氧导致的Lp-a水平的升高(p<0.05)(图3B),然而,通过比较缺氧耐受鼠与缺氧敏感鼠之间Lp-a水平差异并未发现有统计学意义(p>0.05)(图4B)。以上结果表明,小鼠无法通过自身潜能抑制Lp-a的表达,即缺氧累积损伤超出了小鼠自身的生理调节能力,而滁菊干预提供了外源性保护作用。此外,发现Lp-a在缺氧耐受或缺氧敏感鼠中的表达水平极显著地高于缺氧组,这可能是因为前两组的缺氧模式风险更大,提示选择Lp-a作为缺氧死亡风险的评价指标是合理的。

TnT 是缺血性中风病人另一独立的死亡风险因子[17]。与缺氧对照组相比,滁菊预处理能显著抑制缺氧诱导的TnT表达(p<0.05)(图3C),说明滁菊在预防缺氧相关血栓性疾病风险上具有一定的潜力。与缺氧敏感鼠相比,缺氧耐受鼠血清中TnT水平明显减少(图4C),表明TnT表达阻抑对提高小鼠的缺氧耐受力是有利的,滁菊对TnT的下调参与了滁菊的耐缺氧保护机制。

综上所述,在预测缺氧相关死亡及血栓性疾病发生风险方面,TnT是比Lp-a更敏感的预测因子。TnT及HIF-1共同参与了滁菊的耐缺氧保护机制,即滁菊具有提高小鼠缺氧耐受及预防缺氧相关血栓性疾病风险的双重保护作用,这将为滁菊用以预防高原缺氧导致的继发性疾病提供理论依据。