食品中致癌性生物毒素检测标准概述

李 莉,李 硕,王海燕,丁 宏

(中国食品药品检定研究院,北京 100050)

生物毒素,是生物机体分泌的、不可复制的有毒化学物质,对其他生物物种有毒害作用,包括动物、植物、微生物在其生长繁殖过程中或一定条件下产生的有毒物质[1]。根据毒素产生的生物分类,分为细菌毒素、真菌毒素、植物毒素、动物毒素和海洋生物毒素[2]。生物毒素具有较高的生物毒性,如致癌、致畸和肝肾毒性等,摄入被生物毒素污染的食品会对大众健康造成极大危害[2]。近年来,生物毒素导致的食品安全问题受到世界各国和有关国际组织的高度重视[3]。真菌毒素(真菌有毒代谢物)对食品和饲料的污染、藻类毒素(藻类产生的毒素)对水产品的污染以及植物毒素对可食用植物的污染被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)列为食源性疾病的重要根源[4]。

目前,生物毒素尤其是真菌毒素和藻类毒素引发的食品安全问题已经成为各国食品监管关注的重点。由于该类物质具有高风险性,近几十年来许多国家或国际组织制定了诸多有关食品中致癌类生物毒素的法规,对其进行严格控制。随着检测技术的发展和对生物毒素认识的不断提高,生物毒素的检测标准也在不断更新。本文梳理了各个国家部门和地区以及主要国际组织关于致癌性生物毒素限量和检测方法标准,并与我国现行标准进行了比较,找出存在的差异,并对发现的问题提出一些建议,以期为该领域检测方法选择和标准制修订提供参考。

1 食品中常见的致癌性生物毒素

国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)自1971年以来开始对致癌因素进行评估,其中有400多个被确定为对人类致癌或者可能致癌[5]。根据IARC的致癌物质分级列表,目前已明确致癌或可能致癌的生物毒素类有:黄曲霉毒素(1,2012)、黄曲霉毒素M1(2B,1993)、赭曲霉毒素A(2B,1993)、伏马毒素B1(2B,2002)、杂色曲霉毒素(2B,1987)、微囊藻毒素LR(2B,2010)等[5]。常见致癌性生物毒素种类以及化学和毒理学特征见表1。

表1 食品中常见致癌性生物毒素的种类及特征Table 1 Types and characteristics of carcinogenic biotoxins in foods

2 食品中致癌性生物毒素的限量规定

影响食品中真菌和污染物限量标准和法规制定的主要因素包括:食品安全风险评估数据、各类食品中真菌毒素含量范围、可用的检测方法、主要贸易伙伴国家现有的法规以及是否满足足够的粮食需求等[6]。全球各个国家和地区以及国际组织出台的真菌毒素的限量标准各有差异,但均没有覆盖所有的真菌毒素种类。最重要的真菌毒素有:黄曲霉毒素、赭曲霉素A、棒曲霉素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮和一些单端孢霉烯族,如脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素等。表2[9-18]列出中国、欧盟、美国、加拿大和日本等国家和组织法规中给出限量的真菌毒素种类,可以看出,由于饮食结构差异、主要食品种类和居民膳食暴露评估结果的不同,各个国家和地区及国际组织重点监管的真菌毒素的类别有所不同。

表2 国内外食品法规中涉及的主要致癌性真菌毒素Table 2 Major carcinogenic mycotoxins in food regulation at home and abroad

世界卫生组织(WHO)规定微囊藻毒素-LR的每日耐受摄入量(TDI)为0. 04 μg/(kg·d),饮用水中微囊藻毒素-LR的最高限值为1 μg/L[7]。目前世界上大部分国家对于饮用水中微囊藻毒素-LR的限量都沿用了WHO的规定,我国生活饮用水卫生标准(GB 5749-2006)也规定饮用水中微囊藻毒素-LR的浓度不得高于0.001 mg/L[8]。但是对于食品中微囊藻毒素和结球藻毒素,目前世界各国均没有制定限量标准。

3 食品中致癌性生物毒素的检测标准

为了保障限量法规能够得以有效实施,加强食品中致癌性生物毒素的风险控制,许多国家和国际组织出台了配套的标准分析方法。目前,在标准方法制定方面比较有影响力的国际组织有:国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO)、美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)以及欧盟标准委员会(Comité Européen de Normalisation,CEN),它们在制定食品中致癌性生物毒素检测方法标准方面都做了大量的工作[19]。近年来,我国在真菌毒素和藻毒素检测国家标准制修订方面也取得了长足进步,积极和国际标准接轨,已经达到较高的水平。

3.1 黄曲霉毒素的检测标准

黄曲霉毒素作为世界上发现最早、危害最严重的强致癌性真菌毒素,一直受到国际社会的高度重视。ISO、AOAC 以及CEN真菌毒素官方标准中涉及黄曲霉毒素的检测标准是最多的。相较于ISO和CEN而言,AOAC检测方法的检测对象覆盖面广,技术相对比较完善;CEN标准方法在引用了ISO的方法的基础上,对于婴幼儿食品等限量要求较高、适用于特殊人群一类产品另行给出了检测方法。

我国目前现行的食品或粮油中黄曲霉毒素检测标准共9个,包括2个国家标准(GB)、3个出入境检验检疫行业标准(SN)、3个农业行业标准(NY)以及3个粮食行业标准(LS)。食品安全国家标准GB5009.22 和GB 5009.24为强制性国家标准,其余为推荐性标准(见表3[20-33])。我国黄曲霉毒素检测标准方法大致可以分为确认方法和快速检测方法两大类。确认方法主要是基于各种理化仪器设备,如高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法等实验室常规分析方法。快速筛查方法主要是以免疫化学为基础的检测方法,包括免疫亲和柱法、酶联免疫吸附法等,适宜现场使用。由于样品复杂多样及免疫法所用酶的不稳定性,快速筛查方法重现性不如确认方法,容易出现假阳性。和国际主流的检测方法相比较,我国黄曲霉毒素的检测标准从目标化合物到检测技术都达到了国际先进的水平(见表3)。根据近几年标准修订情况和国际主流检测方法发展趋势,目前液相色谱-质谱联用技术以其高准确性、高灵敏度的优势,消除了液相色谱法存在的定性误差,同时同位素内标法可以消除样品提取的损失和基质效应的影响,定量准确,是今后黄曲霉毒素检测技术发展的主要方向。

表3 ISO、AOAC、CEN以及中国食品中黄曲霉毒素检测方法对比Table 3 Comparison of determination methods of aflatoxins in food of ISO,AOAC,CEN and China

3.2 赭曲霉毒素的检测标准

赭曲霉毒素的检测标准多以检测赭曲霉毒素A为主(见表4)。由于不同地区饮食习惯和主要粮食作物的不同,不同国家和地区食品中赭曲霉素A的检测标准主要的适用范围有所差距,ISO提供的赭曲霉毒素A检测方法有2个,适用于谷物及其制品,样品经过不同的前处理后采用高效液相法测定。欧盟在此基础上,针对大麦、烘焙咖啡、葡萄酒、啤酒、葡萄干等干果以及婴幼儿谷类食品等食品制定了各自的检测标准,都采用了免疫亲和柱净化高效液相色谱测定的方法。AOAC早期起草的检测方法多以薄层色谱法为主,近几年发布的方法也采用了目前较为主流的免疫亲和柱净化高效液相色谱法。我国现行的赭曲霉素A检测标准中共有5个,包括1个国家标准和4个行业标准[34-37],适用范围包括谷物、油料、酒类、咖啡、辣椒、酱油等多个食品种类。检测手段涉及高效液相色谱、液相色谱-质谱联用等技术,样品前处理多采用免疫亲和净化。此外我国粮食部门根据我国粮食质量安全监管的需要还制定了用于快速测定的胶体金快速定量法和超高效液相色谱法,用于日常的监测工作。胶体金试纸法检测时间快,步骤简单,灵活性高,适合大量样品快速筛查,不足之处是容易出现假阴性和假阳性。高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用技术更适用于实验室中准确的定性和定量检测,结果较快检方法更加准确可靠。由于赭曲霉素A广泛存在于谷物、及其制品、牛奶、咖啡、香料、酒类和中草药中,样品种类繁多,基质复杂,日常检测工作中可以结合实际需求,选择最为合适的检测方法。

表4 食品中赭曲霉素A的检测方法Table 4 Determination methods of ochratoxin A in food

3.3 镰刀菌属毒素的检测标准

镰刀菌属毒素是近几年关注的重点,该菌属涉及的毒素种类较多,现行的检测标准主要针对受关注度较高的几种毒素,欧盟、AOAC及我国镰刀菌属毒素检测标准见表5。ISO提供了动物饲料中玉米赤霉烯酮的检测标准,但没有涉及食品领域。欧盟标准中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1和B2、T-2毒素和HT-2毒素均制定了相应的检测方法,适用范围为玉米、谷类及其制品,此外还给出了婴幼儿食品中多种毒素的液相色谱-质谱筛查方法。AOAC检测标准主要关注脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和伏马毒素,检测方法种类较全面,有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法和酶联免疫法等,但发布日期都比较早,近几年没有更新新的方法。我国现行镰刀菌属毒素的检测标准包括4个国家标准和7个行业标准[38-47],与AOAC和欧盟的检测标准相比,我国的检测方法涵盖的食品种类较多,检测手段也更为丰富,囊括了常用的检测技术,如薄层色谱法、酶联免疫法、高效液相色谱、液相色谱质谱联用等。新修订的国家食品安全标准采用了同位素稀释液相色谱-串联质谱法,极大地提高了检测的准确性和灵敏度。镰刀菌属毒素种类繁多,污染率高,毒性也较强,是我国粮食、饲料及其制品主要的污染物之一,根据报道,除粮食、饲料外,在油料作物、调味品、乳和乳制品、肉类、发酵产品、干果、水果、蔬菜等都发现了不同程度的污染。由于真菌毒素的研究和监管历史并不长,相当一部分镰刀菌属毒素仍缺乏毒性数据,有待进一步毒理学评估,目前已明确毒性较大的部分真菌毒素,由于缺乏检测标准,未被收录进法定检验项目中。此外现有的检测标准还存在检测对象分散、适用范围窄的问题,有待于进一步的提高和改进。

表5 食品中镰刀菌属毒素的检测方法Table 5 Determination methods of Fusarium mycotoxins in food

3.4 其他致癌性生物毒素的检测标准

棒曲霉素(展青霉素)在水果及其制品、饲料、蔬菜、谷物等中均被不同程度地检测到,尤其是苹果及其制品中污染较为严重[48]。欧盟、AOAC及我国都出台了针对苹果及其制品中展青霉素的检测标准(见表6[49-53]),检测方法以常规的薄层色谱法和液相色谱法为主。我国在新修订的GB 5009.185-2016中首次引入同位素稀释液相色谱-串联质谱法,能够更好地弥补液相色谱法和薄层色谱法的不足,处于世界领先水平。另外有些致癌性生物毒素,如杂色曲霉素、微囊藻毒素,目前国际上尚无该类毒素的限量标准,为了更好地对该类物质进行食品安全风险监测和评估,我国也出台了部分检测标准,检测方法采用液相色谱-质谱联用检测技术。

表6 食品中其他致癌性生物毒素的检测方法Table 6 Determination methods of other carcinogenic biotoxins in food

4 结论与展望

食品安全问题直接关系到人类的身体健康和生命安全。目前世界各国及相关国际机构致力于不断完善食品中的致癌性生物毒素限量和检测方法,根据大量的毒理、暴露量等方面的研究工作,将更多的生物毒素纳入监控范围内。近年来我国食品安全标准体系建设在“四个最严”的指导下,经过不断的完善和发展,已经有了长足的进展,生物毒素的标准检测方法采用不同的分析手段,涵盖了定量分析方法和定性分析方法,部分方法已经达到世界先进水平。但生物毒素种类繁多,性质差异较大,部分物质毒理学危害尚不明确,相关法规和标准尚需进一步完善,仍存在部分致癌性生物毒素没有制定限量以及检测方法缺失或不足的问题。目前致癌性生物毒素检测标准多采用免疫亲和柱净化技术和液相色谱检测,但由于免疫亲和柱专属性较高,不适用于多种毒素的提取净化,不利于大样本量的快速筛查。此外,目前的检测方法多适用于粮食、食用农产品等初始食品种类,存在涵盖食品种类范围窄、存在安全隐患的问题,应加强对其他食品种类中致癌性生物毒素检测方法的开发和研究。近几年发展起来的新型样品富集和净化技术如QuEChERS法、快速固相萃取技术等,以其高选择性、成本低、操作简单等优势,已广泛应用于生物毒素的检验中,此外色谱-质谱技术的普及为生物毒素的检测提供了更有力的检测和确证手段。相信在不久的将来,会有更多的基于新技术、适用于不同食品基质的多种毒素标准检测方法不断出台。新的检测方法的出台也将进一步推进致癌性生物毒素法规和限量标准的完善。