苎麻BnNramp2基因的克隆与生物信息学分析

朱守晶 肖祥云 史文娟

关键词：NRAMP2基因;克隆;序列分析;苎麻

中图分类号：S563.101

文獻标识码：A

文章编号： 1000-4440（ 2019） 03-0749-04

重金属是主要的环境污染物之一，所有重金属对生物都有潜在的危害作用[1-6]。天然抗性相关巨噬细胞蛋白家族（Natural resistance-associated macrophage protein， NRAMP）是一类广泛存在于微生物、植物、动物中的古老且高度保守的膜整合蛋白家族，参与大多数有机体的金属离子（如Fe2+、Cd2+、Mn2+、2n2+、Cu2+、NjZ+、C02+、Al3+）的运输[7-9]。目前，已在许多高等植物中发现了NRAMP家族基因。在拟南芥（Ar-abidopsis thaliana）和水稻（Oryza saliva）基因组中，分别存在6和7个NRAMP家族成员，其中一些NRAMP基因的功能已经比较清楚。拟南芥中的Nrampl、Nramp3和Ⅳramp4基因可以转运Mn、Fe和Cd[10-12]，而Nramp6只能转运Cd[13]。在水稻中也有相关报道，Takahashi等研究发现OsNrampl基因与水稻根系对镉的吸收和转运过程密切相关，该基因在水稻根部表达量的差异也导致水稻品种间的镉积累量呈现差异[14]。Sasaki等将敲除了Nramp5基因的水稻突变体与野生型水稻植株同时种植在含锰和镉的培养基中，发现突变体根中锰和镉的含量及其净吸收量都显著低于野生型[15]。这些发现促进了对植物Nramp基因转运金属离子的研究，也表明Nramp基因在重金属抗性中起着重要作用。

苎麻（Boehmeria niveaL）为荨麻科苎麻属多年生宿根性草本植物[16]。许多研究结果表明，苎麻对重金属镉（Cd）具有较强的耐受和富集能力[17-20]。虽然对其他植物的研究结果表明，NRAMP家族基因在植物对镉的吸收和转运过程中起着关键作用，但目前在苎麻中尚未得到克隆。本研究在苎麻转录组测序的基础上[21]，筛选与拟南芥Nramp2基因同源性较高的苎麻Nramp基因，设计引物通过RT-PCR克隆该基因的开放读码框，并对其进行生物信息学分析，以期为后续的表达分析及功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料为耐镉性较强的苎麻栽培品种中苎一号，种植于宜春学院苎麻资源圃。在苎麻旺长期，选择生长健壮、无病虫害的植株，剪取根部和叶片，液氮速冻，然后置于-80℃超低温冰箱保存，用于RNA的提取。

1.2 生化试剂

RNA提取试剂RNAprep pure plant kit购自天根生化科技（北京）有限公司，PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNAeraser和pMD18-T载体购自TaKaRa公司（日本），Trans2Kplus II DNA marker、TransTaq@ HiFi DNA polymerase、大肠杆菌化学感受态细胞、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯或者化学纯。引物合成和测序由上海生工生物技术服务有限公司完成。

1.3 RNA提取及cDNA合成

按照天根RNAprep pure plant kit试剂盒说明书提取苎麻样品总RNA。按照TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent kit withgDNA eraser试剂盒说明书将RNA反转录为第一链cDNA。

1.4 BnNramp2基因的克隆

基于苎麻镉胁迫转录组中的Unigene拼接序列，利用Primer Premier 5.O软件在开放读码框外侧设计一对特异性引物BnNramp-F（5’-CCGCATCCCCCTCGGCAAATCTCCC-3’）和BnNramp-R（5’-CCTATTTCTGCTCCCACTTCACTTCT-3’），以苎麻cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为：第一链cDNA l.0μl，Buffer 2.5μl，上、下游引物（10 μmol/L）各1.Oμl，dNTP（2.5μmol/L）2.0μl，TransTaq@HiFi DNApolymerase 0.2μl，ddH20 17.5μl。反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，32个循环;72℃延伸7 min，最后4℃保温。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的条带，将回收产物连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，经PCR鉴定后，送阳性克隆至上海生工生物技术服务有限公司进行序列测定。

1.5 BnNramp2基因的生物信息学分析

通过NCBI（美国国立生物技术信息中心）数据库的ORF Finder工具（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）对BnNramp2基因的开放读码框进行查找，并将其翻译成氨基酸序列;利用ExPASy数据库的ProtParam工具（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）对BnNramp2编码氨基酸的组成和理化性质进行分析;利用ExPASy数据库的TMpred工具（ https：//embnet. vital-it. ch/software/TMPRED—form.html）对蛋白质的跨膜结构域进行预测;利用WoLF PSORT在线软件（ https：//www.genscript.com/wolf-psort，html）预测BnNramp2蛋白的亚细胞定位;采用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线软件对蛋白质的信号肽序列进行预测;用SOPMA在线软件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）预测分析蛋白质的二级结构;在NCBI数据库中对氨基酸序列进行BLAST相似性检索（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）;利用NCBI数据库的Conserveddomain search程序（https： //www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白质保守功能域预测;在DNAMAN 8.O软件中进行氨基酸序列的多重比对;利用MECA 5.0软件采用Neighbor-Joining方法构建蛋白质系统进化树，Bootstrap统计学检验次数为500。

2 结果与分析

2.1 苎麻BnNramp2基因的克隆

按照试剂盒说明书提取耐镉苎麻品种中苎一号根部和叶片总RNA，经过1%琼脂糖凝胶电泳后，可以看到清晰的28S和18S条带.且28S条带亮度是18S的2倍左右，基本没有降解，可以满足下一步试验要求。将根部和叶片总RNA等量混合，反转录为cDNA模板。采用BnNramp-F和Bn-Nramp-R引物进行PCR扩增，得到1条1 800 bp左右的特异性条带。切胶回收后连接至pMD18-T载体，送至上海生工生物技术服务有限公司进行测序。采用NCBI网站的OR-Ffinder软件对测得的序列进行ORF查找，结果表明苎麻Bn-Nramp2基因含有一个长度为1596 bp的开放读码框，位于92-1 687 bp处，编码531个氨基酸，与GenBank已登录的其他植物的Nramp2基因相似性较高，将其命名为BnNramp2。

2.2 苎麻BnNramp2蛋白基本性质预测

利用ExPASy数据库的ProtParam工具对BnNramp2基因推导的氨基酸序列进行分析，发现该蛋白质的分子量为5.874x104，等电点为5. 36，含有20种氨基酸，含量最高的为亮氨酸（ 13.6%），含量最低的为半胱氨酸（0.9%），分子式为C2 709 H4 239N677 0742 S18。蛋白质不稳定系数为40. 18，为不稳定蛋白质。利用TMpred工具对BnNramp2的跨膜结构域进行预测，结果表明，BnNramp2蛋白含有12个可能的跨膜区域，对应的氨基酸残基区域分别为72- 90、106- 123、149-173、180- 201、211- 228、255- 274、302- 321、347- 368、391-412、424- 443、460-477、484- 508。利用WoLF PSORT软件对BnNramp2的亚细胞定位进行预测，结果表明BnNramp2蛋白质定位于质膜处。SignaIP 4.1 Server软件分析结果表明，BnNramp2蛋白不含信号肽序列，不属于分泌型蛋白质。

2.3 苎麻BnNramp2蛋白二级结构预测

利用PRABI网站的SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）对BnNramp2蛋白进行二级结构预测，推测该蛋白质主要由a螺旋（a-helix）、延伸链（Extended strand）、β一转角（ Beta turn）和无规则卷曲（Random coil）结构组成，比例分别为54. 80%、12. 62%、3.01%和29. 57%.

2.4 BnNramp2蛋白氨基酸序列比对和结构域分析

利用DNAMAN 8软件对苎麻BnNramp2蛋白和其他植物物种的Nramp蛋白进行多序列比对，发现苎麻BnNramp2蛋白与拟南芥、川桑、山黄麻、桃和梅Nramp2蛋白的相似性较高，相似度分别为80%、86%、84%、83%和83%。利用NCBI的CD-search和ExPASy数据库PROSITE软件分析氨基酸序列的保守结构域，发现BnNramp2蛋白的第92- 455位氨基酸残基为典型的Nramp结构域，同时在第410- 413氨基酸残基处存在一个Ⅳ-糖基化位点（N-glycosylation site），属于Nramp超家族。

2.5 苎麻BnNramp2蛋白统进化分析

为进一步研究苎麻BnNramp2蛋白在物种中的进化位置和亲缘关系，利用MECA 5.O软件对苎麻、川桑、山黄麻、水稻、玉米等不同植物物种的Nramp2氨基酸序列进行进化树分析比较。结果表明，单子叶和双子叶植物Nramp2蛋白明显被聚成2类。苎麻BnNramp2与同为荨麻目的川桑、山黄麻亲缘关系最近，聚为一个亚类，而与单子叶的水稻、玉米的亲缘关系最远。蔷薇目的桃、梅和甜樱桃，锦葵目的棉花、长蒴黄麻，豆科的花生、野生大豆，十字花科的拟南芥、天蓝遏蓝菜和油菜，均分别聚为一个亚类。

3 讨论

植物对土壤中矿质营养元素的吸收与重金属元素的吸收积累关系密切。以往的研究结果表明，砷、镉等有毒重金属元素是通过矿质营养元素的吸收运输通道进入并在植物体中进行分布的[14-15，22]。转运蛋白不仅在植物矿质营养元素的运输过程中起到重要作用，同时也可转运重金属元素。Nramp是一类古老的膜整合蛋白家族，虽然经过长期进化，Nramp基因在各物种之间仍保持着高度的保守性，并在植物吸收转运重金属的过程中起到十分重要的作用[13-15，23]。虽然目前已在一些植物中克隆了多个Nramp家族基因，但在苎麻中至今未见报道。本研究采用RT-PCR技术，首次从耐镉苎麻品种中苎一号中成功克隆了BnNramp2基因的全长编码序列。

Nramp家族成员均为具有膜整合蛋白特征的多肽分子，通常含10-12个跨膜区、1-2个糖基化位点和1个具有转运蛋白特征的结构域[24]。本研究对苎麻BnNramp2基因推导的氨基酸序列进行了分析，发现第92-455氨基酸残基含有一个Nramp蛋白结构域，并在第410 - 413氨基酸残基处存在一个N一糖基化位点。对BnNramp2跨膜结构域的预测结果表明，BnNramp2蛋白含有12个可能的跨膜区域。亚细胞定位预测结果表明，BnNramp2蛋白定位于质膜。以上结果说明，苎麻BnNramp2具有NRAMP蛋白家族的重要特征，是一个典型的Nramp蛋白家族成員。 序列相似性比对和系统进化树分析结果显示，苎麻Bn-Nramp2蛋白与其他植物Nramp2蛋白的相似性及同源性较高，很有可能为Nramps2家族成员。Cao等[25]研究了Cd超积累和非超积累2种类型东南景天在Cd诱导下的基因表达差异，发现在正常生长条件下，Nramp2基因在2种生态型东南景天中表达差异并不显著，但在Cd诱导条件下，Nramp2基因在超积累东南景天中的表达水平要显著高于非超积累生态型，转运蛋白基因在超积累植物中的超量表达可能是其超积累Cd的关键。赵首萍等[26]研究了高Cd积累和低Cd积累2种基因型番茄对Cd胁迫响应的差异，发现高Cd积累型番茄的根系对离子态Cd的高吸收速率与Nramp2、Nramp3和ZIP基因的高表达量有关，可能是其获得高镉积累量的原因之一。这些结果表明，Nramp2基因参与了Cd的吸收转运，因此BnNramp2基因可能与苎麻体内重金属Cd的吸收转运有关。

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（责任编辑：张震林）