利用分子标记辅助选择改良蜀恢527对白叶枯病的抗性

2019-09-10顾建强陈子强林艳郭新睿田大刚

福建农业科技 2019年3期

关键词：水稻

顾建强陈子强林艳郭新睿田大刚

摘要：分子标记辅助选择可快速实现对目标基因的准确选择，为分子育种提供有效工具。以杂交水稻恢复系蜀恢527为受体亲本，以携带抗白叶枯病抗性基因Xa23的IRBBL23为供体亲本，利用杂交、回交育种结合分子标记辅助选择的方法，将广谱持久抗白叶枯病基因Xa23导入到优良恢复系蜀恢527中，获得22份含有Xa23基因的改良株系。用白叶枯病菌致病菌系P6接种改良株系，筛选出1份高抗白叶枯病的新恢复系R527Xa23。进一步考察R527Xa23与不育系谷A、Ⅱ32A和特丰A配制杂交组合的农艺性状，结果显示R527Xa23与蜀恢R527的组合，在穗长、每株穗数、结实率和千粒重等相关农艺性状上相似，表明该恢复系R527Xa23在培育白叶枯病抗性杂交水稻组合上具有广阔的应用前景。

关键词：水稻;蜀恢527;白叶枯病;Xa23;分子标记辅助选择

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.03.002

Abstrat：Molecular markerassisted selection can achieve accurate selection of target genes quickly and provides an effective tool for molecular breeding. Using restorer line Shuhui 527 as receptor parent and IRBBL23， which carrying Xa23， a resistance gene to bacterial blight， as donor parent， the broadspectrum and persistently resistant gene Xa23 was introduced into the restorer line Shuhui 527 by crossing and backcross breeding combined with molecular markerassisted selection， 22 improved lines containing Xa23 gene were obtained. A New Restorer Line R527Xa23 with high resistance to bacterial blight was screened by inoculating the improved strain P6. The agronomic traits of hybrid combinations from R527Xa23 and sterile lines Gu A， Ⅱ32A and Tefeng A were further investigated. The results showed that the improved combinations of R527Xa23 and Shuhui R527 had similar agronomic traits in panicle length， number of panicles per plant and 1000grain weight， which indicated that the restorer line R527Xa23 had broad application prospects in breeding hybrid rice combinations that resistant to bacterial blight.

Key words：Rice; Shuhui 527; Bacterial blight; Xa23; Molecular markerassisted selection

水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌稻黄单胞杆菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzae，Xoo）引起的一种严重的细菌性病害，一般会造成水稻減产10%～30%，严重时可达到50%，甚至颗粒无收[1]。此病害在世界各水稻产区均有发生，尤其在中国、日本和印度发生最为严重[2]。这给水稻生产带来了巨大风险。目前生产上使用化学农药防治白叶枯病不仅成本高、效果差，还存在严重污染生态环境等问题。长期生产实践表明，利用白叶枯病抗性基因培育抗病品种，是解决上述问题的有效措施。

截至2013年3月，经国际注册确认和报道的水稻白叶枯病抗性基因共38个。已被定位的抗性基因有26个，已有7个基因被成功克隆[3]。Xa23是一个广谱持久抗水稻白叶枯病基因，其对现有国内外白叶枯病鉴别菌系（如菲律宾小种1～10、中国致病型小种1～7和日本小种1～3）都表现高抗，且完全显性、全生育期抗病[4]。迄今，该基因已被广泛应用于杂交稻白叶枯病抗性改良[5-10]。

本研究以不抗白叶枯病的恢复系蜀恢527为受体材料，利用回交转育技术和分子标记辅助选择，将抗病基因Xa23导入到该恢复系中。随后，对改良株系及其所配制杂交组合进行抗性和产量评价，以期利用改良的恢复系和不育系配制杂交组合，培育高抗白叶枯病的优良杂交稻。

1 材料与方法

1.1 材料

供体亲本：携有Xa23基因的IRBBL23;受体亲本：恢复系蜀恢527;鉴定菌系：水稻白叶枯病鉴别菌系P6。

1.2 试验方法

1.2.1 将Xa23基因导入受体材料技术路线以恢复系蜀恢527为受体亲本，以IRBBL23为抗体基因供体亲本配制水稻杂交组合，F1自交，与轮回亲本蜀恢527进行回交。连续3次回交和1次自交获得分离群体，利用已开发的EST分子标记C189对分离群体进行筛选，得到含有目的基因Xa23的抗性单株。

1.2.2 抗病基因的检测水稻基因组DNA提取参考张凤娟等的方法[11]。利用王春连等开发的EST标记C189[9]（引物序列由福州擎科生物技术有限公司合成）进行PCR扩增。PCR体系为25 μL，包括2×reaction Mix（含dNTP，Mg2+）12.5 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）1 μL，Gloden Taq polymerase（5 U·μL-1）0.4 μL（天根公司），水稻基因组DNA

（20～30 ng·μL-1）1 μL，ddH2O 9.1 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s;58℃退火30 s;72℃延伸40 s;共35个循环;最终72℃延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，并用凝胶成像系统拍照记录结果。

1.2.3 病原菌接种鉴定将白叶枯病菌强致病菌系P6接种在马铃薯半合成培养基上于28℃培养72 h，用无菌水洗下菌苔并将菌液稀释至6×108 CUF·mL-1。在水稻孕穗期，采用剪叶法进行人工接种菌株。每株材料选择5片叶接种，接种后2～3周进行调查。根据《中国水稻品种试验与审定》中主要病害鉴定方法与标准进行材料抗性评价[12]。

1.2.4 室内考种配制的杂交组合按完全随机区组设计排列种植福建省农业科学院生物技术研究所寿山试验站，每小区种植4行，每行8株，3次重复。参考许桂玲等[13]的方法进行室内考种。

2 结果与分析

2.1 抗性基因Xa23的检测分析

利用抗性基因Xa23的紧密连锁分子标记C189对BC3F2群体单株进行PCR扩增。结果显示，供体亲本扩增出约800 bp的Xa23特征条带，而受体亲本扩增出约900 bp的条带，BC3F2的部分单株扩增出含Xa23的特征条带，说明抗白叶枯病基因Xa23被成功导入到恢复系蜀恢527中。在BC3F2群体中，共检测出22份携带Xa23的纯合株系。

2.2 病原菌接种鉴定分析

将22份改良株系和亲本在孕穗期接种本试验的白叶枯病菌系P6，剑叶剪叶接种水稻白叶枯病发病程度分级标准见表1。接种鉴定结果显示，亲本蜀恢527对白叶枯病表现感或中感，而绝大多数携有抗性基因Xa23的改良系和供体亲本表现抗白叶枯病，其中1份编号为R527Xa23的材料表现高抗白叶枯病。

2.3 杂交组合农艺性状表现

用三系不育系谷丰A、Ⅱ32A和特丰A作母本，分别与纯合的R527Xa23和对照蜀恢527配制杂交组合。考察自然不发病条件下6个组合的穗长、有效穗数、结实率、千粒重等4个农艺性状，并进行统计分析。总体看来，R527Xa23与不育系谷丰A配制的杂交组合，在穗长、每株穗数、结实率和千粒重上与对照差异不显著，且表现出良好的恢复性能（表2）。而对于Ⅱ32A/R527Xa23和特丰A/R527Xa23，其分别在结实率和千粒重上高于对照，达到显著水平。调查结果表明恢复系R527Xa23在培育白叶枯病抗性杂交水稻组合上具有广阔的应用前景。

3 讨论与结论

防治水稻白叶枯病最经济有效的手段就是利用白叶枯病抗性基因培育抗病品种，包括Xa1、Xa3/Xa26、xa5、Xa10、xa13、Xa21、Xa23、xa25 和Xa27。其中，Xa23是从我国普通野生稻种鉴定出的一个优良抗白叶枯病基因，具有抗谱广、抗性导入效应强、完全显性和全生育期抗性等特点。因此，该基因成为我国在杂交稻白叶枯病抗性改良上一个主要基因资源。

目前，水稻抗病育种通常是采用传统育种结合分子标记辅助选择技术对水稻品种进行改良。相比传统抗性育种利用人工接种或发病区鉴定筛选目标植株，该方法具有低资源投入，且不受环境条件限制等优点，能够快速、准确、稳定的改良目标性状。利用这项技术成功地培育出一批含Xa23优良品系，并育成了一系列杂交组合。如：利用分子标记辅助选择已经将Xa23成功导入到闽恢3139[5]，9311、1826[6]，早稻恢復系东南恢01[10]，培矮64S、明恢86和C418[14]和HK01[15]，并显著提高改良品系对白叶枯病的抗性。

蜀恢527（R527）是四川农业大学水稻所育成的一个强恢复系，具有株叶形态好、恢复力强、配合力高、品质优、较抗稻瘟病等特点，其已配组出通过全国或省级审定的多种组合[16]。然而，由于蜀恢527本身及其所采用的不育系都不抗白叶枯病，限制其大面积推广和应用。目前，黄廷友等[17]利用分子标记辅助选择已成功将Xa21和Xa4导入蜀恢527，达到改良其抗白叶枯病的目的。而本研究基于Xa23与Xa21、Xa4抗谱的差异，以及Xa23广阔的应用前景，通过传统抗病育种结合分子标记辅助选择的方法，在相对较短的年限内获得了具有高抗白叶枯病的新的恢复系R527Xa23，而且该恢复系表现出与蜀恢527相似的农艺性状。新材料R527Xa23可作为优良的恢复系用于水稻生产。

参考文献：

[1]吴云雨，王建飞，鲍永美，等.65个水稻主栽品种（系）对白叶枯病菌的抗性鉴定[J].江苏农业学报，2012，28（2）：448-450.

[2]李定琴，钟巧芳，曾民，等.水稻抗白叶枯病基因定位、克隆及利用研究进展[J].中国稻米，2017，23（5）：19-27.

[3]国家水稻数据中心.水稻白叶枯病主效抗性基因列表[EB/OL].（2015-04-27）http：//www.ricedata.cn/gene/gene_xa.htm.

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[5]陈建民，付志英，权宝权，等.分子标记辅助培育双抗稻瘟病和白叶枯病杂交稻恢复系[J].分子植物育种，2009，7（3）：465-470.

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[7]刘维，何秀英，廖耀平，等.利用分子标记辅助选择育种（MAS）技术改良水稻恢复系粤恢826[J].南方农业学报，2017，48（10）：1748-1754.

[8]田大刚，陈在杰，陈子强，等.分子标记辅助选育聚合抗稻瘟病基因和抗白叶枯病基因的水稻改良新恢复系[J].分子植物育种，2014，12（5）：843-852.

[9]王春连，戚华雄，潘海军，等.水稻抗白叶枯病基因Xa23的EST标记及其在分子育种上的利用[J].中国农业科学，2005，38（10）：1996-2001.

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[11]张凤娟，张满良，朱水芳.一种改进的水稻总DNA的快速提取方法[J].植物检疫，2004，18（6）：330-332.