新型小分子激酶抑制剂Ibr—7对人胰腺癌Capan—2细胞的抑制作用及机制研究

阎优优 张博 张琪 周冬梅 林能明

中圖分类号 R966；R735.9 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）04-0499-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.14

摘 要 目的：观察新型小分子激酶抑制剂Ibr-7[依鲁替尼（Ibr）衍生物]对人胰腺癌Capan-2 细胞的抑制作用及其可能机制。方法：以Capan-2细胞为对象，采用CCK-8法检测1、2、4、8 μmol/L Ibr、Ibr-7作用48 h后的细胞增殖情况，计算细胞存活率；同法检测1 μmol/L Ibr、Ibr-7对不同剂量吉西他滨/紫杉醇（均分别为0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）的增敏作用。采用克隆形成试验检测1、2、4 μmol/L Ibr、Ibr-7作用48 h后的细胞克隆形成情况，并记录细胞集落形成数量。采用流式细胞术或JC-1法检测2、4、8 μmol/L Ibr-7作用24或16 h后细胞凋亡情况和线粒体膜电位变化情况，并计算总凋亡率及细胞线粒体膜电位下降比例。采用Western blotting法检测细胞中相关凋亡蛋白[多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）、Noxa、Bcl-2、Bax、髓样细胞白血病1（Mcl-1）、B淋巴细胞瘤xL（Bcl-xL）]的表达情况。结果：1、2、4、8 μmol/L Ibr、Ibr-7作用48 h后，细胞的存活率均显著下降，各剂量Ibr-7组均显著低于同剂量Ibr组，且Ibr-7的半数抑制浓度显著低于Ibr（P<0.05或P<0.01）。联用Ibr、Ibr-7后，细胞的存活率均显著低于同剂量吉西他滨/紫杉醇单用组，且Ibr-7联用组显著低于同剂量Ibr联用组（P<0.05或P<0.01）。经2、4 μmol/L Ibr以及1、2、4 μmol/L Ibr-7作用48 h后，细胞集落形成数量均显著减少，且各剂量Ibr-7组均显著低于同剂量Ibr组（P<0.01）。经不同剂量Ibr-7作用24或16 h后，Capan-2细胞的总凋亡率（2、4、8 μmol/L组）、细胞线粒体膜电位下降比例（8 μmol/L组）以及Noxa（2、4、8 μmol/L组）、Bax（8 μmol/L组）蛋白的相对表达量均显著上升，PARP（8 μmol/L组）、Bcl-2（4 μmol/L组）、Mcl-1（2、4、8 μmol/L组）蛋白的相对表达量均显著下降，且8 μmol/L Ibr-7组上述指标（PARP、Bcl-2相对表达量除外）均显著优于同剂量Ibr组（P<0.05或P<0.01）。而各组细胞Bcl-xL蛋白的相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：与Ibr相比，Ibr-7对人胰腺癌Capan-2细胞具有更强的体外增殖抑制作用和促凋亡作用，且具有更强的化疗药物增敏活性；其作用机制可能与降低细胞线粒体膜电位，下调细胞中PARP、Bcl-2、Mcl-1蛋白的表达，上调Noxa、Bax蛋白的表达有关。

关键词 依鲁替尼；依鲁替尼衍生物；人胰腺癌Capan-2 细胞；增殖；凋亡；线粒体膜电位；凋亡相关蛋白

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe the inhibitory effects and possible mechanism of new small molecular kinase inhibitors Ibr-7 [Irutinil（Ibr） derivatives] on human pancreatic cancer Capan-2 cells. METHODS： Taking Capan-2 cells as objects， CCK-8 method was used to determine the proliferation of cells after treated with 1， 2， 4， 8 μmol/L Ibr/Ibr-7 for 48 h. The survival rates of cells were calculated. Sensitization effects of 1 μmol/L Ibr/Ibr-7 on different doses of gemcitabine/paclitaxel （0.062 5， 0.125， 0.25， 0.5， 1 μmol/L） were detected. Clone formation test was used to detect the situation of cell clone formation after treated with 1， 2， 4 μmol/L Ibr/Ibr-7 for 48 h. The number of cell colony formation was recorded. Flow cytometry or JC-1 method was used to detect the apoptosis of cells after treated with 2， 4， 8 μmol/L Ibr-7 for 24 or 16 h and the changes of mitochondrial transmembrane potential； total apoptotic rate and the percentage of mitochondrial membrane potential decrease were calculated. Western blotting was used to detect the expression of related apoptotic protein （PARP， Noxa， Bcl-2， Bax， Mcl-1， Bcl-xL）. RESULTS： After treated with 1， 2， 4， 8 μmol/L Ibr/Ibr-7 for 48 h， the survival rates of cells were decreased significantly； those of Ibr-7 groups were significantly lower than those of same-dose Ibr groups； IC50 of Ibr-7 was significantly lower than that of Ibr （P<0.05 or P<0.01）. After combined with Ibr/Ibr-7， the survival rate of cells was significantly lower than that of same-dose gemcitabine/paclitaxel alone group， and the Ibr-7 combination group was significantly lower than same-dose Ibr combination group （P<0.05 or P<0.01）. After treated with 2， 4 μmol/L Ibr and 1， 2， 4 μmol/L Ibr-7 for 48 h， the number of cell clone formation was decreased significantly， while Ibr-7 groups were significantly lower than same-dose Ibr groups （P<0.01）. After treated with different doses of Ibr-7 for 24 or 16 h， total apoptosis rate of cells （2， 4， 8 μmol/L）， the proportion of cell mitochondrial membrane potential decrease （8 μmol/L）， the relative protein expression of Noxa （2， 4， 8 μmol/L） and Bax （8 μmol/L） were increased significantly， while the protein expression of PARP （8 μmol/L）， Bcl-2 （4 μmol/L）， Mcl-1 （2， 4， 8 μmol/L） were decreased significantly； above indexes （except for relative expression of PARP and Bcl-2） of 8 μmol/L Ibr-7 group were significantly better than same-dose Ibr group （P<0.05 or P<0.01）. There was no statistical significance in protein expression of Bcl-xL among those groups （P>0.05）. CONCLUSIONS： Compared with Ibr， Ibr-7 has better inhibitory and apoptotic effects on human pancreatic cancer Capan-2 cells in vitro， and has stronger chemotherapeutic drug sensitization activity， the mechanism of which may be associated with reducing mitochondrial transmembrane potential， down-regulating the protein expression of PARP， Bcl-2 and Mcl-1 and up-regulating the protein expression of Noxa and Bax.

KEYWORDS Ibrutinib； Irutinil derivatives； Human pancreatic cancer Capan-2 cells； Proliferation； Apoptosis； Mitochondrial transmembrane potential； Apoptosis-related protein

胰腺癌是目前臨床患者5年生存率最低（仅为5%）的恶性肿瘤之一，因其发病隐匿，绝大多数患者在确诊时已处于晚期；加之晚期胰腺癌极易复发、转移及药物耐受，使得其临床治疗处于瓶颈期[1-2]。吉西他滨作为胰腺癌化疗的一线药物，其临床有效率仅为10%～15%[3-4]。尽管紫杉醇、伊立替康等药物的出现在一定程度上优化了胰腺癌的化疗方案，但其靶向药物的相关研究一直没有突破性进展[5]。因此，寻找有效的针对胰腺癌治疗的小分子靶向药物或合理的联合给药方案迫在眉睫。

依鲁替尼（Ibr，结构式见图1A）是作用于B细胞抗原识别受体（BCR）信号通路的新型小分子靶向药物，可靶向于Bruton酪氨酸激酶（Btk），目前已被美国FDA批准用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、华氏巨球蛋白血症（WM）、小淋巴细胞性淋巴瘤（SLL）和边缘区淋巴瘤（MZL）等B细胞恶性肿瘤的临床治疗。近年多项临床前和临床研究均显示，Ibr对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等多种实体瘤均有较好的疗效，但对胰腺癌细胞的体外抑制活性较差[6-8]。本课题组前期筛选发现，与Ibr比较，其衍生物Ibr-7（结构式见图1B）对胰腺癌细胞株具有更明显的体外抑制作用。在此基础上，本研究考察了Ibr-7对人胰腺癌Capan-2细胞增殖的影响，并初步探讨其可能机制，以期为胰腺癌治疗药物的开发和联合用药方案的设计提供新的治疗靶点和理论依据。

1 材料

1.1 仪器

SpectraMax M3型全波长多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪（美国BD公司）；Micro 21R型高速冷冻离心机、3111型细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc XRS+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；SZ61型体式显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 药品与试剂

Ibr原料药（美国Selleck公司，批号：PCI-32765，纯度：99.92%）；Ibr-7原料药（杭州和正医药有限公司，批号：20161216，纯度：>95%）；注射用盐酸吉西他滨（江苏豪森药业集团有限公司，批号：160901，规格：0.2 g）；紫杉醇注射液（江苏奥赛康药业股份有限公司，批号：E150101，规格：16.7 mL ∶ 100 mg）；RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（美国Gibco公司，批号分别为1930017、1891605、1929955）；CCK-8检测试剂盒（美国MedChemExpress公司，批号：30116）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：SI255483）；膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素（Annexin Ⅴ-FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司，批号：6119908）；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（碧云天生物技术研究所，批号：022618180620）；RIPA裂解液、5×Loading上样缓冲液（北京艾德莱生物科技有限公司，批号分别为292343、291925AX）；10%蛋白电泳通用型预制胶（12孔）（杭州奥谦生物科技有限公司，批号：C30621712）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（0.45 μm，美国Millpore公司，批号：R7E8785B）；免疫印迹化学发光（ECL）试剂盒以及辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（美国Abbkine公司，批号分别为ATRFE2801、ATRFE0501、ATRFE2801）；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TBST）（杭州昊鑫生物科技股份有限公司，批号：20180608XF；临用前加水1 L混匀，即得TBST溶液）；兔抗人多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号：9）；兔抗人PMAIP1（又称Noxa）、Bax、Bcl-2、髓样细胞白血病1（Mcl-1）、Bcl-xL单克隆抗体（美国Abcam公司，批号分别为GR1030343-9、GR3180247-17、GR251056-12、GR168628-1、GR26786-9）；鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）抗体（内参，美国Santa Cruz Biotechnology公司，批号：J0914）；其余试剂均为分析纯，水为三蒸水。

1.3 细胞

人胰腺癌Capan-2细胞购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，以含10%FBS的RPMI 1640培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养。

2 方法

2.1 CCK-8法检测Ibr、Ibr-7对细胞增殖活性和药物敏感性的影响

2.1.1 细胞的增殖活性 收集对数生长期的Capan-2细胞，以5×103个/孔的密度接种于96孔板中（每孔100 μL），于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后，将细胞随机分为空白对照组和给药组[Ibr、Ibr-7剂量均分别为1、2、4、8 μmol/L，剂量设置参考本课题组前期试验的半数抑制浓度（IC50）]。每组设置3个复孔。空白对照组加入RPMI 1640培养基200 μL，各给药组分别加入含相应药物的RPMI 1640培养基200 μL，于37 ℃、5%CO2条件下培养48 h后，弃去培养基，每孔加入含10%CCK-8检测试剂的RPMI 1640培养基100 μL，于37 ℃、5%CO2条件下培养1 h。采用全波长多功能酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值，并计算细胞存活率[细胞存活率（%）=给药组细胞的平均OD值/空白对照组细胞的平均OD值×100%]；采用GraphPad Prism 5软件计算IC50。上述试验重复操作3次（下同）。

2.1.2 细胞的药物敏感性 收集对数生长期的Capan-2细胞，以5×103个/孔的密度接种于96孔板中（每孔100 μL），于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后，将细胞随机分为空白对照组和吉西他滨单用组（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）、紫杉醇单用组（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）、Ibr单用组（1 μmol/L）、Ibr-7单用组（1 μmol/L）以及Ibr+吉西他滨联用组、Ibr-7+吉西他滨联用组、Ibr+紫杉醇联用组和Ibr-7+紫杉醇联用组（联用组剂量均为1 μmol/L+0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L），各给药组剂量设置均参考本课题组前期预试验结果。每组设置3个复孔。空白对照组加入RPMI 1640培养基200 μL，各给药组分别加入含相应药物的RPMI 1640培养基200 μL，于37 ℃、5%CO2下培养48 h后，弃去培养基，每孔加入含10%CCK-8检测试剂的RPMI 1640培养基100 μL，于37 ℃、5%CO2条件下培养1 h后，按“2.1.1”项下方法测定并计算细胞存活率。

2.2 克隆形成试验检测细胞的克隆形成能力

收集对数生长期的Capan-2细胞，以1×103个/孔的密度接种于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后，将细胞随机分为空白对照组和给药组（Ibr、Ibr-7剂量分别均为1、2、4 μmol/L，剂量设置依据参考“2.1.1”项）。每组设置3个复孔。空白对照组加入RPMI 1640培养基2 mL，各给药组分别加入含相应药物的RPMI 1640培养基2 mL，于37 ℃、5%CO2条件下培养48 h后，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）清洗2次，弃去上清液，加入含10%FBS的RPIM 1640培养基2 mL，于37 ℃、5%CO2条件下培养1～2周。待克隆形成后，弃去培养基，用PBS清洗2次，用0.1%结晶紫染色液染色1 h，用PBS洗净后，晾干，用体式显微镜观察细胞集落形成数量并拍照。

2.3 流式细胞术检测细胞的凋亡情况

收集对数生长期的Capan-2细胞，以2×105个/孔的密度接种于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后，将细胞随机分为空白对照组和给药组（Ibr-7剂量分别为2、4、8 μmol/L，Ibr、吉西他滨的剂量均为8 μmol/L，剂量设置依据参考“2.1.1”项）。每组设置3个复孔。空白对照组加入RPMI 1640培养基2 mL，各给药组分别加入含相应药物的RPMI 1640培养基2 mL，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后，收集贴壁细胞。贴壁细胞用PBS清洗2次后，依次加入AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒中的缓冲液100 μL以及AnnexinⅤ-FITC染液、PI染液各5 μL，混匀，染色15 min后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，使用FACSDiva v8.0.1软件计算细胞总凋亡率[细胞总凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率]。

2.4 JC-1染色法检测细胞内线粒体膜电位变化情况

收集对数生长期的Capan-2细胞，以2×105个/孔的密度接种于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后，按“2.3”项下方法分组。每组设置3个复孔。空白对照组加入RPMI 1640培养基2 mL，各给药组分别加入含相应药物的RPMI 1640培养基2 mL，于37 ℃、5%CO2下培养16 h后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，收集细胞。细胞用PBS清洗2次后，加入RPIM 1640培养基500 μL和JC-1工作液500 μL，混匀，染色30 min后，采用流式细胞仪检测细胞膜电位变化情况，使用FACSDiva v8.0.1软件计算细胞线粒体膜电位下降比例。

2.5 Western blotting法检测细胞中凋亡相关蛋白的表达情况

收集对数生长期的Capan-2细胞，以2×105个/孔的密度接种于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后，按“2.3”项下方法分组。每组设置3个复孔。空白对照组加入RPMI 1640培养基2 mL，各给药组分别加入含相应药物的RPMI 1640培养基2 mL，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。各孔细胞经RIPA裂解液裂解后，采用BCA法以蛋白定量检测试剂盒测定其总蛋白浓度。蛋白经上样缓冲液稀释后，于100 ℃沸水中变性5 min，冷却，1 000 r/min离心5 min，将沉淀置于-80 ℃保存，备用。以β-actin为内参进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），随后转移至PVDF膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h后，分别加入PARP、Noxa、Bax、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL、β-actin一抗（1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育过夜；用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的二抗（1 ∶ 5 000），室温孵育1 h，再用TBST溶液洗膜3次，每次10 min。以ECL显色后，置于凝胶成像系统上成像并采用ImageJ 1.46r软件进行分析。以目标蛋白条带与内参条带的灰度值之比表示目标蛋白的相对表达量。

2.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用t檢验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Ibr、Ibr-7对Capan-2细胞增殖活性和药物敏感性的影响

3.1.1 细胞的增殖活性 与空白对照组比较，经不同剂量Ibr、Ibr-7作用48 h后，Capan-2细胞的存活率均显著下降，且各剂量Ibr-7组的细胞存活率均显著低于同剂量Ibr组，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；Ibr-7的IC50值为（2.3±0.2）μmol/L，显著低于Ibr的（20.4±1.1）μmol/L，差异有统计学意义（P<0.01），详见表1。

3.1.2 细胞的药物敏感性 与空白对照组比较，经不同剂量吉西他滨（0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）、紫杉醇（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）分别作用48 h后，Capan-2细胞的存活率均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；联用Ibr或Ibr-7后，Capan-2细胞的存活率均显著低于同剂量吉西他滨、紫杉醇单用组，且联用Ibr-7组的细胞存活率均显著低于同剂量联用Ibr组，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），详见表2、表3。

3.2 Ibr、Ibr-7对Capan-2细胞克隆形成的影响

与空白对照组比较，各剂量Ibr、Ibr-7组的细胞集落形成明显减少，2、4 μmol/L Ibr组以及1、2、4 μmol/L Ibr-7组的细胞集落形成数量均显著减少，且各剂量Ibr-7组均显著低于同剂量Ibr组，差异均有统计学意义（P<0.01），详见图2、表4。

3.3 Ibr、Ibr-7对Capan-2细胞凋亡的影响

与空白对照组比较，各剂量Ibr-7组细胞的总凋亡率均显著升高，且8 μmol/L Ibr-7组显著高于同剂量Ibr组，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），详见图3、表5。

3.4 Ibr、Ibr-7对Capan-2细胞线粒体膜电位的影响

与空白对照组比较，各剂量Ibr-7组细胞的线粒体膜电位均不同程度地降低，8 μmol/L Ibr-7组细胞的线粒体膜电位下降比例显著升高，且显著高于同剂量Ibr组，差异均有统计学意义（P<0.05），详见图4、表5。

3.5 Ibr、Ibr-7对Capan-2细胞线粒体凋亡相关蛋白表达的影响

与空白对照组比较，各剂量Ibr-7组细胞PARP（8 μmol/L组）、Bcl-2（4 μmol/L组）、Mcl-1（2、4、8 μmol/L组）蛋白的相对表达量均显著下降，Noxa（2、4、8 μmol/L组）、Bax（8 μmol/L组）蛋白的相对表达量显著升高；且8 μmol/L Ibr-7组Noxa、Bax、Mcl-1蛋白的相对表达量均显著高于同剂量Ibr组，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；而Bcl-xL蛋白的相对表达量均未见显著变化（P>0.05），详见图5、表6。

4 讨论

Ibr是一种靶向B细胞淋巴瘤中BtK的小分子抑制剂，但对胰腺癌细胞的体外抑制效果不佳。本课题组在前期研究中合成并筛选了一系列Ibr衍生物，发现Ibr-7对胰腺癌Capan-2细胞具有较强的抑制增殖和诱导凋亡的作用。故在此基础上，本研究采用CCK-8法检测了Ibr、Ibr-7对细胞增殖活性和药物敏感性的影响。结果显示，经不同剂量Ibr、Ibr-7（1～8 μmol/L）作用48 h后，Capan-2细胞的存活率均较空白对照组显著降低，且Ibr-7的IC50值显著低于Ibr。这提示这两种化合物对Capan-2细胞的体外增殖均有一定的抑制作用，且Ibr-7的作用明显强于Ibr。同时本研究结果还显示，联用1 μmol/L的Ibr或Ibr-7后，吉西他滨和紫杉醇对Capan-2细胞增殖的抑制作用均显著增强（联用组细胞的存活率均显著低于同剂量吉西他滨、紫杉醇单用组）；且与联用Ibr相比，联用Ibr-7后抑制作用增强更为明显。这提示Ibr-7可更明显地提高Capan-2细胞对吉西他滨、紫杉醇的敏感性，但具体的增敏机制仍有待后续研究进一步探讨。

克隆形成试验结果显示，经不同剂量（根据增殖试验和药物敏感性试验结果，将剂量确定为1～4 μmol/L）Ibr、Ibr-7作用48 h后，Capan-2细胞的克隆形成受到明显抑制，其细胞集落形成数量均较空白对照组显著降低，且Ibr-7组显著低于同剂量Ibr组，差异均有统计学意义。这提示这两种化合物对Capan-2细胞的克隆形成具有一定的抑制作用，且Ibr-7的抑制作用强于Ibr。

线粒体膜电位下降是细胞早期凋亡的重要标志之一[9]。JC-1是一种阳离子染料，当线粒体膜电位较高时，其可聚集至细胞基质中，形成复合物而发出红色荧光；而当线粒体膜电位降低时，JC-1则无法聚集，以单体形式存在而发出绿色荧光，故可根据荧光的变化来检测细胞线粒体膜电位的改变情况[9]。本研究对细胞凋亡和线粒体膜电位的检测结果显示，经不同剂量Ibr-7作用后，Capan-2细胞的总凋亡率（2、4、8 μmol/L组）和线粒体膜电位下降比例（8 μmol/L组）均较空白对照组显著上升，且8 μmol/L Ibr-7组显著高于同剂量Ibr组，差异均有统计学意义。这提示与Ibr相比，Ibr-7可更明显地促进Capan-2细胞的凋亡、降低其线粒体膜电位。

肿瘤细胞凋亡过程中，Bcl-2家族蛋白可通过与其他凋亡蛋白的协同作用来调控线粒体结构和功能的稳定性，具有细胞凋亡“主开关”的作用[10]。该家族蛋白可根据功能差异分为抗凋亡蛋白（Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（Noxa、Bax等）。其中，Bcl-2主要存在于线粒体、内质网和核膜上，其在增强线粒体膜电位、保持线粒体内外膜的完整性等方面起着重要作用；而Bax蛋白则可直接激活死亡效应因子胱天蛋白酶（Caspase），从而导致细胞凋亡；此外，Bcl-2还可与Bax结合形成异源二聚体，抑制细胞凋亡；故当Bcl-2表达下调时，两者的动态平衡受到破坏，异源二聚体的合成明显减少，细胞凋亡得以发生[11]。由此可见，以Bcl-2为代表的抗凋亡蛋白是肿瘤治疗的有效靶点之一。Mcl-1是Bcl-2家族蛋白中主要的抗凋亡蛋白，可通过与Noxa等促凋亡蛋白的结合来调控其自身的表达水平和降解能力[12-13]。Bcl-xL可通过降低细胞线粒体膜的通透性、抑制细胞色素等一系列物质的释放来发挥抗细胞凋亡的作用[14]。PARP作为细胞凋亡核心成员Caspase的切割底物，其在DNA损伤修复和细胞凋亡中发挥着重要作用[15]。由此可见，调节凋亡相关蛋白的表达水平可能成为有效的抗癌策略之一。本研究结果显示，不同剂量Ibr-7组细胞中PARP（8 μmol/L组）、Bcl-2（4 μmol/L組）、Mcl-1（2、4、8 μmol/L组）蛋白的相对表达量均显著下降，Noxa（2、4、8 μmol/L组）、Bax（8 μmol/L组）蛋白的相对表达量均显著升高，差异均有统计学意义。这提示Ibr-7可通过调控线粒体凋亡蛋白PARP、Noxa、Bax、Bcl-2、Mcl-1等的表达来发挥促细胞凋亡的作用。此外本研究结果还显示，8 μmol/L Ibr-7组细胞Noxa、Bax、Mcl-1蛋白的相对表达量均显著高于同剂量Ibr组，差异均有统计学意义。这提示与Ibr比较，Ibr-7对促凋亡蛋白Noxa、Bax具有更强的上调作用，而对Mcl-1的下调作用则相对较弱。但本研究并未发现Ibr-7对Bcl-xL表达的影响。

综上所述，与Ibr相比，Ibr-7对人胰腺癌Capan-2细胞具有更强的体外增殖抑制作用和促凋亡作用，且具有更强的化疗药物增敏活性；其作用机制可能与降低线粒体膜电位，下调细胞中PARP、Bcl-2、Mcl-1蛋白的表达，上调Noxa、Bax蛋白的表达有关。由此可见，Ibr-7有望成为一种有效的新型抗胰腺癌小分子靶向药物，具有一定的开发价值。但本研究仅初步探讨和比较了Ibr、Ibr-7的体外增殖抑制作用、增敏作用和促凋亡作用，而其具体作用机制仍有待后续研究进一步完善。

参考文献

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（收稿日期：2018-05-10 修回日期：2018-12-06）

（編辑：张元媛）