白头翁皂苷B4对肝癌细胞Huh—7及其荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用及机制研究

薛淑一 李明春 苗青 周煜

中圖分类号 R965；R735.7 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）05-0601-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.06

摘 要 目的：研究白头翁皂苷B4（AB4）对肝癌细胞Huh-7及其荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用及机制。方法：将Huh-7细胞分为AB4给药组、阴性对照组（等体积培养液）、阳性对照组（5-氟尿嘧啶50 μmol/L），运用MTT法检测0、3、6、12、25、50、100、200、400、800、 1 600 μmol/L AB4作用Huh-7细胞12、24、36、48 h的增殖抑制率，计算半数抑制浓度（IC50）；克隆形成试验评估50 μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h的克隆细胞数；膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）染色检测50 μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h的细胞凋亡率；Western blot法检测50 μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h后B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、活化胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶（Cleaved PARP）等凋亡蛋白的表达。将荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（5-氟尿嘧啶50 mg/kg）和AB4低、中、高剂量组（25、50、100 mg/kg），每组3只，每天腹腔注射相应药物1次，连续19 d，观察裸鼠肿瘤生长情况，计算抑瘤率；苏木精-伊红（HE）染色观察肿瘤细胞形态变化。结果：AB4对Huh-7细胞的增殖抑制率随给药浓度的增加而增加，但50 μmol/L后增加不明显，随作用时间的延长而增加，但作用24 h后增加不明显，AB4的IC50为（56.76±1.756） μmol/L。与阴性对照组比较，50 μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h的克隆细胞数明显减少、Bcl-2蛋白表达明显减弱（P<0.05），细胞凋亡率和Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达均明显增加（P<0.05或P<0.01），且与阳性对照组差异无统计学意义。与阴性对照组比较，AB4低、中、高剂量组和阳性对照组荷瘤裸鼠的瘤体积明显减小（P<0.05），肿瘤细胞轮廓逐渐模糊，出现核固缩、核质不清晰、核碎裂现象，其抑瘤率分别为25.93%、39.15%、46.26%、42.83%。结论：AB4对Huh-7细胞及其荷瘤裸鼠均有抑制作用，其机制可能与上调Bax/Bcl-2比例、活化Caspase-3、裂解PARP、诱导细胞发生凋亡有关。

关键词 白头翁皂苷B4；肝癌细胞Huh-7；荷瘤裸鼠；抑制作用；机制

Inhibitory Effects and Mechanism of Anemoside B4 on Hepatocellular Carcinoma Huh-7 Cells and Tumor- bearing Nude Mice

XUE Shuyi1，2，LI Mingchun2，MIAO Qing2，ZHOU Yu2，3（1.Dept. of Pharmacology， School of Pharmacy， Qingdao University， Shandong Qingdao 266021， China；2.Dept. of Pharmacy， No. 971 Hospital of the Navy of PLA， Shandong Qingdao 266071， China；3.College of Pharmacy， Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116044， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the anti-tumor effect of anemoside B4 （AB4） on hepatocellular carcinoma Huh-7 and tumor-bearing nude mice and its mechanism. METHODS： Huh-7 cells were divided into AB4 treatment group， negative control group （constant volume of culture medium） and positive control group （5-fluorouracil 50 μmol/L）. The inhibitory rate of Huh-7 cell proliferation was tested by MTT after treated with 0， 3， 6， 12， 25， 50， 100， 200， 400， 800， 1 600 μmol/L AB4 for 12， 24， 36， 48 h； IC50 were calculated. The number of clone cells was evaluated by clone formation tests after Huh-7 cells were treated with 50 μmol/L AB4 for 24 h. The apoptosis rate of Huh-7 cells was tested by Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining after treated with 50 μmol/L AB4 for 24 h. The expression of apoptotic proteins such as Bcl-2， Bax， Caspase-3， Cleaved Caspase-3 and Cleaved PARP were tested by Western blot after Huh-7 cells were treated with 50 μmol/L AB4 for 24 h. Tumor-bearing nude mice were randomly divided into negative control group （normal saline）， positive control group （5-fluorouracil 50 mg/kg）， AB4 lwo-dose， medium-dose and high-dose groups （25， 50， 100 mg/kg）， with 3 mice in each group. They were given relevant medicine intraperitoneally， once a day， for consecutive 19 d. The growth of tumor was observed， and anti-tumor rate was also calculated. HE staining was used to observe the morphology of tumor cells. RESULTS： The inhibition rate of AB4 on Huh-7 cell proliferation increased with the increase of concentration of AB4， but it did not increase significantly after reaching 50 μmol/L； it increased with the increase of time， but it did not increase significantly after 24 h. The IC50 of AB4 was （56.76±1.756） μmol/L. Compared with negative control group， the number of clone cells was decreased significantly after Huh-7 cells were treated with 50 μmol/L AB4 for 24 h， while the protein expression of Bcl-2 was decreased significantly （P<0.05）； the apoptotic rate， the protein expression of Bax， Caspase-3， Cleaved Caspase-3 and Cleaved PARP were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， there was no statistical significance， compared with positive control group. Compared with negative control group， the volume of tumor was decreased significantly in AB4 low-dose， medium-dose and high-dose groups， positive control group （P<0.05）； the outline of tumor cells become more and more blurred； there were nuclear pyknosis， unclear nucleoplasm and nuclear fragmentation； its anti-tumor rates were 25.93%， 39.15%， 46.26%， 42.83%， respectively. CONCLUSIONS： AB4 inhibits Huh-7 cells and tumor-bearing mice， the mechanism of which may be associated with up-regulating the proportion of Bax/Bcl-2， activating Caspase-3， cracking PARP and inducing apoptosis.

KEYWORDS Anemoside B4； Hepatocellular carcinoma Huh-7； Tumor-bearing nude mice； Inhibitory effect； Mechanism

肝癌是常见的恶性肿瘤，发病率位于世界总癌症的第6位，病死率位于第4位，是导致男性死亡的第二大癌症[1]。导致肝癌发生的危险因素主要包括以乙型、丙型肝炎病毒为代表的病毒因素；遗传、变质食物中的黄曲霉毒素、水质污染导致泛滥的蓝绿藻类毒素、过度吸烟饮酒、非酒精性脂肪肝等非病毒因素[2]。中国是肝癌高发地区，尤其是乙肝导致的肝癌[1]。目前索拉菲尼是美國FDA唯一批准的晚期肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）治疗的药物[3]，一旦耐药，就没有其他标准治疗方案适用[4]。为此，寻找能够治疗肝癌的新的化学结构实体并研究其作用机制尤为重要。白头翁皂苷B4（Anemoside B4，AB4）来源于毛茛科的植物白头翁，传统医学记载，白头翁有清热解毒、凉血止痢的功效[5]，其主要成分为三萜皂苷、三萜酸、胡萝卜苷、木脂素等[6]。白头翁皂苷（Pulsatilla chinensis saponin）作为一种三萜皂苷，具有抗肿瘤活性，中国民间有应用其治疗乙肝的实例[7]。而单体AB4是白头翁皂苷的主要活性成分，但其抗癌活性与机制尚不清楚。因此，本研究拟从体内和体外探究AB4对肝癌细胞Huh-7的潜在抑制作用，并初步探讨其分子机制，以期为AB4更好地开发利用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

YXQ-LS-50A型全自动立式电热压力蒸汽灭菌器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；CB型CO2培养箱（德国Binder公司）；XDS-1B型显微镜（上海光学仪器厂）；SW-CJ-2F型超净工作台（上海苏净实业有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（常州亿通分析仪器制造有限公司）；TGL16型离心机（长沙英泰仪器有限公司）；ELx800型酶标仪（美国Bio-Tek公司）；Accuri C6型流式细胞仪（美国BD公司）；910型凝胶成像系统（上海山富科学仪器公司）；Mini-Protean Tetra型垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司）；WH-1型微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。

1.2 药品与试剂

AB4（上海爱必信生物科技有限公司，批号：wkq16032901，纯度：98%）；5-氟尿嘧啶（5-FU，北京索莱宝科技有限公司，批号：F8301，纯度：98.0%～102.0%）；DMEM培养基、胰蛋白酶、青霉素/链霉素双抗（美国Hyclone公司，批号：AD16191267、J170046、J170042）；胎牛血清（澳大利亚AusGeneX公司，批号：FBSSA01016-2）；Matrigel胶（美国BD公司，批号：356234）；B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）兔单克隆抗体、Bcl-2相关X蛋白（Bax）兔多克隆抗体、胱天蛋白酶3（Caspase-3）兔多克隆抗体、活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶（Cleaved PARP）兔多克隆抗体、β-肌动蛋白（β-actin）兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（美国CST公司，批号：3498、2772、9662、5625、8457、7074）；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒、膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒、苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0009、C1062、C0105）；HRP底物化学发光液（美国Millipore公司，批号：1702302）。

1.3 细胞

人肝癌细胞Huh-7购自中国科学院典藏培养物保藏委员会上海细胞库。

1.4 动物

BALB/c裸鼠，SPF级，♂，4 周龄（28～34 d），体质量 15～18 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006；将裸鼠置于22～26 ℃、湿度40%～60%的环境中，自由摄食与饮水，笼具等均经高压灭菌处理后使用，保持垫料干燥清洁，适应性饲养1周后用于实验。本实验遵守实验动物福利与伦理原则，经解放军海军第九七一医院伦理委员会批准，编号为401LL-2017010。

2 方法与结果

2.1 细胞培养

将Huh-7细胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗溶液的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。2～3 d传代，取对数生长期细胞进行试验。

2.2 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以 x±s表示，多组间比较采用单因素和双因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett’s t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2.3 MTT试验检测细胞增殖抑制率

收集对数生长期的Huh-7细胞，用0.25%的胰酶消化，调整细胞悬液的浓度至5×104 mL-1，以每孔5 000 个/200 μL的接种量接种于96孔板，放回培养箱中继续培养，待细胞贴壁融合至70%～80%，加入磷酸盐缓冲液（PBS）配制的AB4（终浓度分别为0、3、6、12、25、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L），同时设置空白对照组（无细胞）、阳性对照组（50 μmol/L 5-FU），每组3个复孔。药物与细胞作用12、24、36、48 h后，每孔加入 5 mg/mL的MTT溶液10 μL，继续孵育4 h，加入100 μL Formazan溶解液，混匀后孵育4 h，光学显微镜下观察紫色结晶全部溶解，用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度（A），试验重复3次，计算细胞增殖抑制率[细胞增殖抑制率（%）=（ 1-A给药组/A阴性对照组）×100%]和半数抑制浓度（IC50）。不同浓度AB4对Huh-7细胞增殖抑制率的影响见图1，AB4作用不同时间对Huh-7细胞增殖抑制率的影响见图2。

由图1可知，与AB4 0 μmol/L比较，AB4 6～1 600 μmol/L作用12、24、36、48 h对Huh-7细胞增殖均有抑制作用（P<0.05或P<0.01），其增殖抑制率均随AB4给药浓度的增加而增加，6～50 μmol/L浓度间增加幅度较大，50～1 600 μmol/L浓度间细胞抑制率增加幅度减小。其中50 μmol/L AB4的细胞增殖抑制率与阳性对照组最接近。因此后续试验中AB4的给药浓度均定为50 μmol/L。

由图2可知，AB4对Huh-7细胞的增殖抑制率随作用时间的延长而增加，作用24 h后增殖抑制率的增加幅度减缓，因此后续试验作用时间定为24 h。根据以上结果，计算50 μmol/L AB4作用24 h对Huh-7细胞的IC50为（56.76±1.756） μmol/L。

2.4 克隆形成试验评估AB4的长期抑制效果

将Huh-7细胞以2.5×106个/孔的密度接种在6孔板中，37 ℃下孵育24 h，加入50 μmol/L的AB4（AB4组），同时设置阴性对照组（等体积培养液）、阳性对照组（50 μmol/L 5-FU），作用24 h后，台盼蓝染色计数，以每孔 1 000个细胞重新铺板到6孔板中，孵育14 d，用冷PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色20 min后流水清洗染色液，放置空气中干燥，肉眼计数。结果显示，与阴性对照组比较，AB4组和阳性对照组均能够显著抑制Huh-7细胞的克隆形成，AB4的抑制效果与 5-FU无明显差异。各组细胞的克隆形成图见图3。

2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI染色评估细胞凋亡率

收集对数生长期的Huh-7细胞，以2.5×105个/孔接种到24孔板中，37 ℃、5% CO2孵育过夜后，加入50 μmol/L的AB4（AB4组），同时设置阴性对照组（等体积培养液）、阳性对照组（50 μmol/L 5-FU），作用24 h后，PBS清洗2次，以1×106 mL-1重悬至结合缓冲液（Binding buffer），加入Annexin Ⅴ-FITC和PI混匀，室温避光孵育10～30 min，随后置于冰浴中，上流式细胞仪检测，试验重复3次，计算细胞凋亡率（凋亡细胞数/细胞总数×100%）。结果显示，阴性对照组、AB4组、阳性对照组的细胞凋亡率分别为2.99%、68.63%、64.94%。与阴性对照组比较，AB4组和阳性对照组的细胞凋亡率明显增加（P<0.01），AB4组与阳性对照组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。这表明AB4可显著提高Huh-7细胞凋亡率。各组细胞凋亡的分布图见图4。

2.6 Western blot法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达水平

将Huh-7细胞接种于6孔板中，继续培养至细胞贴壁融合至70%～80%，加入50 μmol/L的AB4（AB4组），同时设置阴性对照组（等体积培养液）、阳性对照组（50 μmol/L 5-FU），作用24 h，用细胞裂解液裂解各组细胞获得细胞总蛋白，BCA试剂盒测定总蛋白含量，100 ℃下5 min蛋白变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入凋亡相关蛋白Bcl-2兔单克隆抗体、Bax兔多克隆抗体、Caspase-3兔多克隆抗体、Cleaved PARP兔多克隆抗体、β-actin兔单克隆抗体（稀释比例均为1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜。隔日加入HRP标记山羊抗兔IgG（稀释比例为1 ∶ 1 000），室温孵育1 h，将增强型化学发光（ECL）显色剂覆盖于膜的蛋白面，于化学发光凝胶成像仪中显影拍照，用Image J对蛋白条带进行分析，以目标蛋白灰度值与β-actin蛋白灰度值的比值评价目标蛋白的表达量，将阴性对照组各蛋白相对表达量设为“1”，评价其他组各蛋白的相对表达量，试验重复3次。各组细胞凋亡相关蛋白的电泳图见图5，测定结果见图6。

由图6可知，与阴性对照组比较，AB4组和阳性对照组细胞中Bcl-2蛋白相对表达量明显降低（P<0.05），Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白相对表达量均明显增加（P<0.05或P<0.01），且AB4组与阳性对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。由此表明，AB4抑制肝癌细胞增殖的作用可能与细胞凋亡有关。

2.7 荷瘤裸鼠的抑瘤作用檢测

收集对数生长期的Huh-7细胞，1 000 r/min离心5 min后重悬于PBS中，与Matrigel胶等体积混合，调整细胞浓度为1×107 mL-1，皮下注射于裸鼠右侧腋下部位，接种量为0.2 mL，5 d后，裸鼠右上肢腋下观察有黄豆大小肿瘤生成（体积约为20～40 mm3），即为造模成功。随后，用游标卡尺测量肿瘤长径与短径，计算瘤体积=（长×宽2）/2。待裸鼠瘤体积长至100～150 mm3，将荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（50 mg/kg 5-FU）和AB4低、中、高剂量组（25、50、100 mg/kg），每组3只，按预实验结果设置给药剂量，每日腹腔注射相应药物1次，给药体积均为10 mL/kg，连续给药19 d。从第1次腹腔注射药物开始，每隔1 d测量1次肿瘤的长径与短径，并计算瘤体积。末次给药后处死裸鼠，剥离肿瘤，称体质量，计算抑瘤率，同时将肿瘤组织放入10%甲醛中固定待用。抑瘤率（%）=（1-给药组瘤质量/阴性对照组瘤质量）×100%。结果显示，注射药物19 d后，荷瘤裸鼠无中毒症状，体质量无明显差异（P>0.05）。与阴性对照组比较，AB4低、中、高剂量组和阳性对照组荷瘤裸鼠瘤体积明显减小（P<0.05或P<0.01），第19天的瘤体积分别减小了24.18%、33.31%、43.20%、37.57%；抑瘤率分别为25.93%、39.15%、46.26%、42.83%。不同给药时间后各组荷瘤裸鼠瘤体积的变化曲线见图7。

2.8 肿瘤组织病理学检查

将固定在10%甲醛中的肿瘤组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片等步骤后，进行HE染色并封片，光镜下观察肿瘤组织结构的改变。病理切片显示，阴性对照组细胞核大小较均一，无明显的形态学改变；AB4低、中、高剂量组和阳性对照组肿瘤组织细胞轮廓模糊，细胞边界不清晰，形状不规则，大小不一，出现核固缩、核质不清晰、核碎裂等现象，上述现象随AB4剂量的增加越明显。各组荷瘤裸鼠肿瘤细胞的形态图见图8。

3 讨论

原发性肝癌包括HCC、肝内胆管细胞癌（Intrahepatic cholangi-Ocarcinoma，ICC）和混合性肝细胞胆管癌（Combined hepatocellular-cholangiocarcinoma，CHC）[8]，其中最常见的为HCC。当前对肝癌的治疗方法主要有手术治疗[9]、放射治疗[10]、化学[11]及生物治疗[12]等，尽管我国一直致力于对肝癌的研究，并在肝癌的检测和治疗方面取得进展，但由于肝癌发病机制复杂、早期诊断困难、治疗水平限制及肿瘤进展迅速且易转移等，导致患者复发率高、预后较差[13]。关于肝癌的药物治疗现况，目前主要是化疗药物与小分子靶向药物及之间的联合用药。化疗药物毒性强、特异性差，在杀死癌细胞时，往往正常细胞也会“受灾”；小分子靶向药物特异性强、毒性小，但是仍存在耐药问题。这主要是因为细胞信号通路非常复杂，抑制一种信号通路，很可能会使其他信号通路产生代偿性改变。

Bax和Bcl-2是参与Caspase依赖性细胞凋亡过程中的相关蛋白，Bax作为促凋亡蛋白，Bcl-2作为抑凋亡蛋白，共同调节细胞凋亡过程[14-15]。Bax可单独形成同源二聚体，促进细胞发生凋亡；也可以与Bcl-2一起形成异同源二聚体，抑制细胞发生凋亡，同源二聚体的稳定性小于异同源二聚体[16]。研究发现，Bcl-2和Bax的比例关系对于细胞凋亡至关重要[17]，降低抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平的表达，增强促凋亡蛋白Bax蛋白水平的表达，从而使Bax/Bcl-2比例升高，可促使细胞发生凋亡。另外，Caspase家族是细胞凋亡过程中重要的半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-3蛋白酶是凋亡级联反应中的主要角色。Bcl-2是通过抑制细胞色素C释放[18]，从而抑制Caspase家族相关蛋白酶激活，阻止细胞凋亡发生；相反，作为线粒体膜的离子通道成分的Bax能促使细胞色素C释放入线粒体，激活Caspase家族，活化Caspase-3，裂解PARP[19]，使其失去生物活性，损伤核内DNA，引发细胞凋亡发生[17]。本研究初步发现，AB4可能通过下调Bcl-2，上调Bax，增大Bax/Bcl-2比例，激活Caspase家族，活化Caspase-3，作用于PARP，进而促使肝癌细胞发生凋亡，从而发挥抗肿瘤作用，其诱导凋亡的具体关系机制则需进一步研究。

本试验结果发现，AB4作为白头翁皂苷的主要活性成分，具有抗肝癌活性。先前研究表明，从P. chinensis saponins中提取的其他活性化合物也具有抗肿瘤活性，如白头翁皂苷A（PSA）、白头翁皂苷D（PSD）及23-羟基白桦酸（23-HBA）。PSA通过诱导DNA损伤，调节p53、细胞周期蛋白B（Cyclin B）和Bcl-2蛋白表达诱导细胞发生凋亡[20]。PSD的分离物SB365能通过抑制Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化，调节PI3K/Akt/mTOR通路抑制细胞生长和血管生成[21]，该通路在细胞凋亡方面占据重要地位[22]。23-HBA的衍生物B4G2则能增强活性氧介导的细胞内钙积累，刺激线粒体Ca2+渗透性转换孔开放，导致线粒体形态改变，引发线粒体依赖的细胞凋亡，抑制肝癌细胞增殖[23]。因此，可尝试采用AB4联合白头翁皂苷其他活性成分，通过作用不同的通路共同诱导肝癌细胞发生凋亡，产生协同作用。另外，白头翁皂苷提取的活性产物还能与化疗药物联合用药。研究表明，SB365能协同化疗药物增强对宫颈癌细胞HeLa的敏感性，增强其抗癌活性[24]； 23-HBA与阿霉素有协同抗癌作用[25]，若将AB4与化疗药物联用，也会为化疗药物联合用药多提供了一种选择。这表明AB4未来可能是一种很有价值的抗癌药。

当前，来源于植物的天然产物已在临床上有广泛的应用，是目前的研究热点，特别是应用于临床无法治愈的恶性肿瘤，因此，AB4具有良好的开发应用前景。本研究率先证明AB4能够抑制肝癌细胞Huh-7的增殖，抑制肝癌裸鼠异种移植模型肿瘤的生长，并初步探索了其诱导凋亡的机制，这为AB4将来在临床上可能作为一种小分子靶向药物的辅助治疗药物提供了依据。下一步实验可补充AB4對肝癌的药效学及机制研究，全面进行AB4的药物代谢、生物毒性、稳定剂型的研究，以期研发一种治疗效果好、副作用小、质量稳定的中药新制剂。

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（收稿日期：2018-10-11 修回日期：2019-01-11）

（編辑：邹丽娟）