细菌内毒素检查法研究进展

王娅宁 高龙

摘   要：细菌内毒素广泛存在于人们的生活中，可引起人体发热、白细胞减少、微循环障碍、内毒素休克、弥散性血管内凝血等症状，在药品生产过程中不可避免地会引入细菌内毒素，所以药品质量控制中对内毒素的检测尤为重要。目前，细菌内毒素的检测方法有家兔热原试验法、鲎试剂法、微量凝膠法、重组C因子法、酶联免疫法等检测方法。文章对这几种检测方法进行综述，比较各自的优缺点，以期为内毒素的检测提供更合理有效的方法。

关键词：细菌内毒素检查法;鲎试剂;微量凝胶法;重组C因子法

细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁上的脂多糖，在极微量（1～5 ng/kg体重）的情况下便可引起人体发热、白细胞减少、微循环障碍、全身炎症反应及多器官功能衰竭等严重不良反应，所以在药物生产中，尤其是注射剂的生产中，细菌内毒素的控制与检测非常重要，关乎人们的生命安全。

细菌内毒素的检测方法：家兔热原试验法、鲎试剂法、微量凝胶法、重组C因子法、酶联免疫法等检测方法。《中华人民共和国药典》（2015版）规定细菌内毒素的检测采用鲎试剂检测法。鲎试剂是由美洲鲎或东方鲎的血液中变形细胞的溶解物提取而成。我国每年对鲎试剂的需求为1 000万支，使我国鲎资源面临着巨大压力[1]。由于近些年浅海环境的恶化，人们肆意地捕食，我国的鲎资源急剧减少，所以，寻找细菌内毒素检查法的替代方法和补充方法已经迫在眉睫[2]。

1    细菌内毒素检查方法分析

1.1  家兔法

由于家兔对热原的反应与人基本相似，所以，采用家兔耳缘静脉注射的方式，监测家兔体温，用来定性检测热原。但是家兔法存在很多缺点，如：不能定量检测热原、使用动物实验、检测周期长、灵敏度低等，因此家兔法正在逐步被取代。

1.2  鲎试剂法

鲎试剂法是目前检查细菌内毒素的常用标准，鲎试剂主要含有：C因子、B因子、G因子、凝固蛋白酶原等物质，其反应原理是：首先C因子与细菌内毒素结合被激活为酶活性形式，然后活化的C因子将B因子活化，活化的B因子将凝固蛋白酶原活化为凝固蛋白酶，凝固蛋白酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白形成凝胶[3]。鲎试剂法具有操作简单、高灵敏度、易于推广等优点，已经广泛应用于药品检测，但鲎试剂法在检测某些复杂成分的药品时，需要排除很多干扰因素，给检验工作增加了负担，同时由于鲎资源逐渐枯竭，寻找鲎试剂法的替代方法也是最近几年的研究重点。

1.3  微量凝胶法

微量凝胶法是采用微量鲎试剂与微量供试品反应的一种检测方法，在无菌环境下加样品10 μL，和鲎试剂平铺在无热原的平板上进行反应，使用含2%亚甲基蓝的70%乙醇溶液为染料，滴在凝胶样本上，若形成坚实凝胶，染料会顺着凝胶滑落，记录为阳性;若未形成凝胶，样本将被染色，记录为阴性。裴宇盛等[4]选取了74个品种的232批次的样品，分别采用凝胶法和微量凝胶法进行试验，结果判断相同的为221批，占95.2%，根据数据分析，微量法的阴性结果可靠，更加灵敏，但假阳性率相对较高。《欧洲药典》7.0版已收录了微量凝胶法且已使用多年，但微量凝胶法在我国的实际应用中还存在着一些问题，如：（1）有部分厂家生产的鲎试剂只能使用自己生产的检查用水才能判断检查结果。裴宇盛等[4]的试验发现个别厂家在使用微量凝胶法时，试验结果出现难以区分阳性和阴性的问题，但用鲎试剂厂家提供的检查用水时，有助于解决该问题，这是因为我国鲎试剂厂家在生产工艺上存在着差别，这种差别所带来的影响在微量法中被放大了。（2）目前，我国还未制定微量凝胶法的统一标准，试验结果的判定存在一定的主观性。（3）含有表面活性剂的样品不适合使用微量法，如果样品中含有表面活性剂，会使液体摊散在酶标板上，进而在水浴孵育时使液体蒸发，导致无法观察结果。（4）微量法使用的染色剂中含有高浓度乙醇，乙醇挥发会导致凝胶融化，使结果全部为阴性，因此在染色结束后应马上观察结果。所以，微量凝胶法优缺点比较明显，阴性结果可靠，假阳性率太高，可以利用微量凝胶法进行大批量样品筛查，其不确定结果可以使用凝胶法进行验证或者仲裁。微量凝胶法在未来经过经验的积累，制定统一的标准之后，有望收录进我国药典。

1.4  重组C因子法

重组C因子是由东方鲎或者美洲鲎的基因克隆而成，具有与C因子一样的生理活性。目前，我国已成功开发重组C因子试剂盒且已上市[5]，其原理是使用单一的蛋白质C因子作为活性成分参与反应，被内毒素活化的C因子将人工合成的三肽链荧光底物裂解，产生荧光复合物，通过定量检测荧光复合物来量化细菌内毒素。其优点是因为没有B因子的存在，从而有效地避免了因G因子的旁路干扰而产生的假阳性。裴宇盛等[6]选用了我国生产的抗生素、中药注射液、生化药品、重组技术产品、病毒疫苗和单克隆抗体6个具有代表性的品种进行干扰试验。结果回收率均在50%～200%范围内，表明该6个品种在我国均可用重组C因子法进行检测。近些年来，虽然我国关于重组C因子的制备研究增多[7-8]，但是有关重组C因子的应用研究比较少[9-10]，能提供的试验经验很少，重组C因子法在我国还没有取得法定地位。根据文献提供的数据支持，仍需要大力推广重组C因子法，获得更多的实验数据，为重组C因子法收录进我国药典作铺垫。

2    发展趋势

微量凝胶法与重组鲎C因子法目前已经具备了全面推广的条件，在推广使用中可以收集到大量的应用数据，逐步形成一套标准的检测方法，然后便可收录进我国药典，同时还应该探索灵敏度更高、适应性更强的方法。如Grallert H等[11]制备了一种对细菌内毒素核心保守区域具有高度特异性和选择性的噬菌体蛋白，实现了对内毒素的特异性捕捉。该方法是重组C因子法和ELISA法的结合，其具体步骤为将样品吸附到预先包被的酶标板上，然后将样品基质洗脱，加入重组C因子，重组C因子被内毒素活化，活化的C因子与荧光底物反应，产生荧光。该方法检测范围为0.05～500 EU/mL，用15种不同菌株的内毒素，同时用这种方法与细菌内毒素检查法测定，结果数值呈线性相关（R2=0.91）[11]。该方法具有明显的优势，如：假阳性、假阴性结果更少，灵敏度更高，检测范围更广，适用性更强。我国也有关于ELISA法检测细菌内毒素的研究，但并未使用重组C因子法检测。张梦等[12]采用分子印迹法，以多巴胺为功能单体，内毒素为模板分子，在酶标板形成包被抗体MIP，用于吸附内毒素，MIP的吸附性与多巴胺的聚合时间有关，多巴胺膜越厚吸附能力越强。周卓晟[13]采用多粘菌素B作为酶标板的包被材料，作为内毒素的吸附剂。分子印迹法产生的MIP与多粘菌素B都具有价格低廉、易于制备的优点，可以大批量的生产制备，可以尝试用这两种材料来吸附细菌内毒素。

3    结语

目前，我国东南沿海海域的中华鲎和圆尾鲎因为栖息环境的破坏和大量捕食等原因数量急剧减少，甚至某些地区濒临灭绝。应该积极地推广和使用细菌内毒素检查法的替代方法，减少鲎试剂的使用量，使鲎资源变成可持续发展的资源，长期地造福人类。

[参考文献]

[1]李裕红，颉晓勇，关杰耀.活化石中国鲎濒危现状及抢救性保护宣言[J].湿学，2018（16）：118-120.

[2]翁朝红，谢仰杰，肖志群，等.福建及中国其他沿岸海域中国鲎资源分布現状调查[J].动物学杂志，2012（47）：42-50.

[3]李世崇，胡显文，胥照平.鲎C因子的性质、结构、功能及应用[J].中国生物工程杂志，2003（5）：78-81.

[4]裴宇盛，蔡  彤，陈  晨，等.微量凝胶法检查细菌内毒素方法学验证研究[J].中国新药志，2018（27）：16-20.

[5]王  征.生物制剂内毒素检测新技术-重组C因子内毒素检测试剂盒的开发和应用[C].北京：第六届生物技术药物理化特性分析与质量研究技术研讨会，2018.

[6]裴宇盛，蔡  彤，陈  晨等.重组C因子法检测细菌内毒素的方法适用性研究[J].中国药业，2019（28）：25-28.

[7]张轶岭，祁  静，张  春，等.昆虫细胞表达鲎C因子内毒素活性检测的研究[J].生物技术，2017（27）：76-81.

[8]祁  静，刘  涛，李  珍，等.Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒在家蚕幼虫中表达重组鲎C因子[J].生物工程学报，2014（30）：111-118.

[9]裴宇盛，蔡  彤，高  华.细菌内毒素检查新方法进展[J].药物分析杂志，2014（34）：19-22.

[10]裴宇盛，蔡  彤，陈  晨，等.重组C因子法检测福沙匹坦二葡甲胺中细菌内毒素的方法学研究[J].中国现代应用药学，2019（36）：5-8.

[11]GRALLERT H，LEOPOLDSEDER S，SCHUETT M，et al.EndoLISA：a novel and reliable method for endotoxin detection[J].Nat Methods，2011（10）：3.

[12]张  梦.基于人工抗体的内毒素快速检测方法研究[D].武汉：华中科技大学，2013.

[13]周卓晟.检测细菌内毒素的酶联免疫吸附法及免疫传感器法的研究[D].武汉：华中科技大学，2010.