乙酰基-11-酮-β-乳香酸对大鼠关节软骨细胞体外培养的作用

何明为 姚军 韦庆军

摘要：目的：观察乙酰基-11-酮-β-乳香酸（AKBA）对大鼠关节软骨细胞增殖和表型维持的影响。方法：取3天龄的SD乳鼠的软骨细胞进行体外培养。利用MTT法检测AKBA对细胞的毒性作用;设置空白组和低、中和高浓度AKBA药物组;番红O观察AKBA对软骨细胞分泌糖胺聚糖（GAG）的影响;qRT-PCR分析AKBA干预对软骨特異性基因表达的影响。结果：低、中和高浓度AKBA组对细胞增殖、软骨特异性基因相对表达量均明显高于空白组（P均<0.05），尤以中浓度组促进作用最显著。结论：AKBA具有促进软骨细胞增殖的作用，可作为潜在的治疗骨关节炎的药物。

关键词：乙酰基-11-酮-β-乳香酸;骨关节炎;关节软骨;增殖

【中图分类号】R-3    【文献标识码】A    【文章编号】2107-2306（2019）06-015-02

乙酰基-11-酮-β-乳香酸（Acetyl-11-keto-β-boswellic acid， AKBA）是一种从乳香树胶树脂中提取出的有效活性化合物。有研究表明，作为一种药物化合物，AKBA曾被用于治疗炎症[1]、溃疡[2]和癌症[3]等疾病;AKBA还可改善膝关节骨性关节炎（osteoarthritis， OA）患者疼痛、僵硬和功能[4]。然而，AKBA对OA的作用机制尚不清楚。基于AKBA对软骨细胞具有保护及促进增殖作用的假设，本研究旨在探讨AKBA对软骨细胞增殖和软骨特异性基因表达的影响，为研究AKBA对OA的治疗作用提供实验依据。

1材料与统计方法

1.1 材料

药物购于MedChenExpress （MCE）公司（https：//www.medchemexpress.cn/AKBA.html），其化学结构如图1A所示。主要试剂：DMEM培养基（高糖）、0.25%胰蛋白酶、青链霉素混合液、MTT细胞毒性试剂盒和番红O染色试剂盒购于北京索来宝科技有限公司，RT-PCR试剂盒购于上海吉凯生物科技有限公司，胎牛血清（FBS）购于美国Gibco公司。

1.2 统计方法

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计处理。数据以（`x ± s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2方法与结果

2.1 AKBA对SD乳鼠关节软骨细胞增殖作用的影响

为检测AKBA对SD乳鼠关节软骨细胞增殖作用的影响，取出生3日龄的乳鼠原代软骨细胞进行培养至第三代。将软骨细胞接种于96孔板，每孔5000个细胞，置于恒温培养箱中过夜。第二天加入含有不同浓度AKBA的培养基，分别干预3天。之后向每孔培养基中加入20μL的MTT，继续在恒温箱中孵育4小时后将多余培养基吸走，加入200μL DMSO并在黑暗条件下孵育15分钟。最后用Multiskan GO微板分光光度计在570nm处测定光密度值。如图1B所示，AKBA在小于40μM 时对软骨细胞增殖具有促进作用，尤其在6.25 μM时，促细胞增殖作用达到最高。

2.2细胞爬片染色

为观察AKBA作用于软骨细胞后的细胞外基质糖胺聚糖（GAG）的分泌情况，我们对细胞生长爬片进行了番红O染色。将第三代软骨细胞接种于铺有细胞爬片的24孔板中，每孔10000个细胞，置于恒温培养箱中过夜后，弃去培养液及未贴壁的细胞，将每块孔板随机分为4组（空白对照组、低浓度组（1.5 μM）、中浓度组（6.25 μM）和高浓度组（25 μM）），每组6个孔，共24孔。待药物干预满三天后终止培养，用4%多聚甲醛溶液固定细胞爬片30分钟，之后进行按照染色试剂盒上的说明书进行操作。染色结果如图2所示，在AKBA干预3天后，中浓度（6.25 μM）组的细胞数量最多，同时红染面积也越大。表明AKBA能促进软骨细胞分泌GAG，对有体外二维培养的软骨细胞的增殖有促进作用。

2.3 AKBA对软骨细胞特异性基因表达的影响

为分析AKBA对软骨细胞特异性基因的影响。将第三代软骨细胞接种于6孔板中，置于恒温培养箱中过夜后，分别加入含有低（1.5 μM）、中（6.25 μM）和高（25 μM）浓度的AKBA培养基，继续干预3天。随后采用RT-PCR检测软骨细胞II型胶原（）和聚蛋白多糖（）的mRNA扩增水平，并通过分析比较各个基因的表达情况。本研究所用引物如下：（上游：GTCCTACAATGTCAGGGCCA;下游：ACCCCTCTCTCCCTTGTCAC）;（上游：GAATGGGAGCCAGCCTACAC;下游：GAGAGGCAGAGGGACTTTCG）;（上游：TCCAGTATGACTCTACCCACG;下游：CACGACATACTCAGCACCAG）。实验结果如图3显示，加入AKBA后软骨特异性基因和明显都得到上调（p<0.05），尤其是中浓度（6.25 μM）组上调效果最明显。

3讨论

据了解，OA是关节炎中最常见的一种类型，已被认为是影响全世界数十亿人的疾病之一，其特点是关节软骨慢性退行性变，关节疼痛，关节功能紊乱等[5]。关节软骨作为一种再生能力较差的组织，在疾病、衰老或创伤的影响下，容易在结构上发生破坏或退化，从而导致OA的发生发展。在OA进展过程中，包括促炎因子（如MMP13、IL6和ADAMTS4等）在内的分解代谢因子被激活，诱导软骨逐渐自我破坏，影响了软骨细胞外基质（ECM）的合成和分泌，进而加深加快OA的严重程度[6]。因此，发掘具有软骨保护作用和维持软骨细胞功能的药物能为OA的治疗提供新的思路。

AKBA，是乳香酸类植物的主要成分，具有多种生物学活性，包括抗炎、抗病毒、抗癌作用等。以往有研究报道，AKBA可改善OA患者疼痛、僵硬和功能，然而，其作用机制尚不清楚。在本研究中，我们通过观察關节软骨细胞增殖和表型维持来检测AKBA的作用。该研究发现，经AKBA干预3天后，低、中、高浓度的三组AKBA均对关节软骨细胞的增殖能力的产生促进作用;通过评估番红O染色发现，AKBA在维持软骨细胞外基质分泌GAG方面有明显的效果，尤其在6.25 μM时促进细胞增殖的作用最显著。有研究表明，在软骨细胞去分化后，和的表达会减少[7]，而本研究通过qRT-PCR发现，AKBA治疗后和表达不减反升，提示AKBA可能具有抑制软骨细胞的去分化的作用。

综上所述，本研究证实AKBA对大鼠关节软骨细胞增殖和功能方面有积极作用。结果提示AKBA可促进大鼠关节软骨细胞的增殖和维持其表型，可能成为治疗OA软骨损伤的潜在治疗药物。

参考文献：

[1]Banno， N.， et al.， Anti-inflammatory activities of the triterpene acids from the resin of Boswellia carteri. J Ethnopharmacol， 2006. 107（2）： p. 249-53.

[2]王文芳， et al.，乳香酸药理活性研究进展.生命的化学，2015. 35（4）： p. 537-542.

[3]Wang， F.， et al.， Two new triterpenoids from the resin of Boswellia carterii. Journal of Asian Natural Products Research， 2011. 13（3）： p. 193-197.

[4]乳香-姜黄素制剂治疗膝骨关节炎的临床评价.国外医药（植物药分册），2005，20（1）：34-35.

[5]Chen， Y.， et al.， Association between bisphosphonate use and risk of undergoing knee replacement in patients with osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases， 2018. 78（2）： p. annrheumdis-2018-212998.

[6]Luo， L.， et al.， Protocatechuic acid benefits proliferation and phenotypic maintenance of rabbit articular chondrocytes： An in？？？vitro study. Experimental & Therapeutic Medicine.

[7]Huang， X.， et al.， Protective effects of baicalin on rabbit articular chondrocytes in vitro. Exp Ther Med， 2017. 13（4）： p. 1267-1274.

基金项目：广西研究生教育创新计划项目（YCSW2019109）