中药石香膏对糖尿病大鼠糖尿病溃疡创面中AGEs、VEGF、CD34含量影响的研究

周一夫 费冀 张开伟 凌一鸣 沈冯君

[摘要]目的：研究中药石吞膏对大鼠糖尿病溃疡的愈合作用及对溃疡创面肉芽组织中晚期糖基化终末产物（AGEs）、血管内皮生长因子（VEGF）、高度糖基化的i型跨膜糖蛋白（CD34）含量，从分子水平来探讨中医药促进创面修复的机理，为糖尿病溃疡的预防及治疗的进一步研究提供理论依据。方法：将40只清洁SD大鼠随机分为4组，为正常对照组、阳性对照组、贝复济组、石香膏组，每组每时间点（7d/14d）5只。造模成功后，贝复济组创面以贝复济喷湿纱布覆盖，石香膏组创面外敷石香膏。第7门4天，取大鼠背部创面肉芽组织标本，IHC法检測各组大鼠背部创面样本（肉芽组织）中的AGEs、VEGF、CD34。结果：（1）7天的样本，与正常对照组对比，阳性对照组含量明显上调，贝复济组含量明显上调、石香膏组的AGEs的含量明显下调，与阳性对照组比较，各给药组AGEs的表达下调;与石香膏组比较，贝复济组的AGEs含量。14天时间点的样本，与正常对照组对比，阳性对照组、贝复济组、石吞膏组的AGEs的含量明显上调，与难愈合组比较，各给药组AGEs的表达下调，与石吞膏组比较，贝复济组的AGEs、含量上调：（2）在7天与14天时间点的样本与正常对照组对比，阳性对照组VEGF、CD34含量下调，贝复济组、石吞膏组VEGF、CD34的含量明显上调，与阳性对照组比较，各给药组的VEGF、CD34明显含量上调：与石吞膏组比较，贝复济组的VEGF、CD34表達下调。结论：使用石吞膏对于糖尿病溃疡创面的治疗，能够明显抑制AGEs，并促进VEGF、CD34表达上调对于创面修复具有显著促进作用。

[关键词]石香膏;糖尿病溃疡治疗;AGEs、VEGF、CD34

[中图分类号]R285[文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）07-016-06

创面愈合过程是复杂的，包括了组织学、内分泌学和生物力学等一整套动态过程，影响其过程的因素包括整个机体和局部情况。糖尿病溃疡作为其最常见并发症之一，给患者个人以及全社会都带来了严重负面影响。我国糖尿病患者不仅数量惊人，且患病率也高于全球平均水平，在2017年高达10.9%。在糖尿病患者中大约15%到25%皮肤因各种因素溃疡，且病情常常反复，长时间难以愈合，严重者会导致截肢甚至引发脓毒血症而危及生命。在全国名老中医沈冯君教授的经验基础上，贵州中医药大学附属医院院内制剂“石香膏”通过长期的临床应用观察到对于糖尿病溃疡的治疗具有良好效果，且已经进行了大量相关基础研究得出了石香膏有促进了提高bFGF等生长因子的表达，使创面肉芽组织加快了生长速度从而缩短创面愈合时间。本研究通过建立糖尿病溃疡大鼠模型，根据AGEs、VEGF、CD34含量来研究石香膏外用于糖尿病溃疡创面的治疗以及相关机制，为该药更深层次研究以及临床应用提供相关的实验基础。

1 实验材料

1.1实验动物;采用SD大鼠40只，体重300g-350g，要求清洁级且为雄性。由贵州医科大学实验动物中心提供，生产许可证征号：SCXK（黔）2012-0001，许可证证号：SYXK（黔）2012-0001，在常温下于贵州医科大学实验动物中心实验室分笼喂养。

1.2实验动物分组及饲养：40只清洁剂雄性SD大鼠（由贵州医科大学动物中心提供）饲养在贵州医科大学动物中心，实验室温度尽量保持在25℃，湿度大约为50%，明暗周期12小时，不限制进食饮水，先通过适应性喂养，在3周称重。随机分为5组，共设2时间点（分别为造模后7d/14d），每组每时间点5只，共40只。（本实验场地以及动物饲料均由贵州医科大学动物实验室中心提供）

1.3实验主要药品、试剂、化学药品、耗材：石香膏（贵阳中医学院第一附属医院中药制剂室制备）、重组牛碱性成纤维细胞成长因子（贝复济）（珠海亿胜生物制药有限公司）、柠檬酸钠缓冲液（上海远慕生物有限公司）、链脲佐菌素（上海远慕生物有限公司）、水合氯醛（上海化学试剂采购供应五联化合厂）、注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司）、一抗：AGEs（美国）、一抗：VEGF（美国）、一抗：CD34（兔来源）abeam（美国）、一抗稀释液（中国）、二抗稀释液（中国）、HRP标记的二抗（美国）、PBS（中国）、DAB（中国）、H202（中国）、酒精（中国）、二甲苯（中国）、苏木素（中国南京）、中性树胶（中国北京）、多聚甲醛（中国上海）、TritonX-100（中国上海）、山羊血清（USA）

1.4实验试剂制备：（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH20定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存。（2）4%多聚甲醛固定液：4g多聚甲醛，50-80ml PBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，定容100ml，4℃保存。（3）另外，准备双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、苏木素。

1.5实验仪器：血糖仪（德国贝朗）、电热压力蒸汽消毒器（YXQ-LS-100A）（上海博讯实业有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（中国上海）、电子分析天平（瑞士）、倒置显微镜（日本）、纯水仪（USA）、切片机（德国）、展片机（德国）、烤片机（德国）

0.6分析软件：Image-pro-plus 6.0、SPSS23.0

2 研究方法

2.1造模及模型评价

2.1.1建立诱导糖尿病大鼠模型及模型评价：造模前18h禁食，自由饮水;于造模当日，对随机30只大鼠（日后分为阳性对照组、石香膏组、贝复济组）以电子称称取体重，以血糖仪测得尾部采血而得出基础血糖值;接下来使用pH为4.0的0.1mmol/L柠檬酸钠缓冲液溶解STZ配制成1%浓度，根据65mg/kg体重，对大鼠注射STZ溶液，3天后检测其随机血糖，当测得大于16.7mmol/L时，为糖尿病模型。（测得血糖大于33.3mmol/L时可以使用诺和灵R 1-4U/d，以控制血糖，提高实验数据准确性），而随机10只大鼠作为正常对照组大鼠仅注射浓度为0.1mmol/L柠檬酸钠缓冲液。

2.1.2建立糖尿病溃疡大鼠模型：注射一周后，剃去4组大鼠背部毛发，予以硫化钡再次脱毛，根据3ml/KG体重腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后造模区（腰椎正中偏上）备皮，以标准无菌操作根据圆形区域剪除表皮层、真皮层以及皮下，造成与深层筋膜外界相通的创口即造模成功。待止血后，对创面用双层生理盐水浸润无菌纱布加双侧两层无菌干纱布固定。为预防感染，对所有大鼠连续注射青霉素，时间为术前一天开始总共4天，用量按照4000U/只。随后分笼防止互相破坏伤口，并予充足饮水饲料。

2.1.3动物用药：除正常对照组共10只之外，剩余已建立糖尿病溃疡模型的30只大鼠。造模成功1周后再进行随机分组：阳性对照组10只、石香膏组10只、贝复济组10只，石香膏组大鼠使用石香膏均匀涂抹消毒纱布上厚度约2mm，对创面完全覆盖，再以消毒医用纱布覆盖固定;贝复济组使用贝复剂完全浸透纱布，按创面大小剪成小块贴于创面上达到完全覆盖，随后加盖两层消毒干纱布固定。阳性对照组及正常对照组仅使用双侧消毒干纱布覆盖固定。石香膏组、贝复济组每日换药，正常组对照及阳性对照组则更换消毒纱布覆盖。

2.1.4标本采集：用药后的第7天、14天分别对大鼠注射麻醉（使用10%水合氯醛），取背部创面肉芽组织作为标本。一部分标本使用10%甲醛溶液固定后，制成石蜡块保存;另一部分使用干冰达到-70℃条件保存。

2.2IHC检测各组大鼠背部创面肉芽组织中AGEs、VEGF、CD34含量

2.2.1实验原理：免疫组化是根据抗原与抗体的特异性结合原理，来定位、定性及定量组织细胞当中的抗原。

2.2.2实验方法

2.2.2.1组织石蜡制作：（1）用PBS清洗，4%多聚甲醛固定;（2）脱水;（3）透明;（4）透蜡;（5）包埋;（6）切片;（7）烤片。

2.2.2.2石蜡切片脱蜡复水：（1）脱蜡：将石蜡切片分别浸泡于二甲苯I、二甲苯II和1/2二甲苯中，各10min。（2）复水：将脱蜡后的石蜡切片浸泡于100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇I、95%乙醇Ⅱ、85%乙醇、75%乙醇中，各5min。（3）雙蒸水清洗3次，每次2min。（4）PBS漂洗，3x2min;

2.2.2.3抗原热修复：是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。

2.2.2.4免疫组化：（1）在切片组织上滴加0.5%TritonX-100室温打孔20min，PBS浸洗切片3次，每次3min。（2）3%H202处理（室温）15min，PBS浸洗切片3次，每次3min。（3）山羊血清室温封闭60min。（4）取出甩于封闭液;一抗孵育（VEGF稀释比1：200，CD34稀释比l：200，AGEs稀释比1：400），4℃过夜。（5）PBS清洗标本3次各5min。（6）二抗孵育37℃ 30min。（7）PBS清洗标本。（8）DAB显色。（9）蒸馏水。（10）苏木素复染。（11）水洗返蓝。（12）梯度酒精脱水。（13）二甲苯透明。（14）中性树胶封片。

2.2.3免疫组化图像分析：应用显微图像采集系统对免疫组化图像进行摄片。随后使用IPP 6.0图像分析软件操作并得出平均光密度值（MOD）

2.2.4统计学处理：应用SPSS23.0统计软件的单因素方差分析功能，以及对组间比较的成组，检验功能（设定P<0.05表示有统计学意义）。对得出的数据采用平均值（X+S）表示。

3 结果

3.1实验造模的评价：用血糖仪测定基础血糖全部低于16.7mmol/L;随后阳性对照组、石香膏组、贝复济组共30只大鼠，按方法注射SIZ溶液，未发生大鼠死亡。3天后测定随机血糖全部大于167毗且小于333mmol/L，表明制作糖尿病模型成功。

3.2IHC检测各组大鼠背部创面肉芽组织中AGEs、VEGF、CD34含量结果

3.2.1各组大鼠背部创面肉芽组织中AGEs的含量：7天的样本，与正常对照组对比，阳性对照组含量明显上调（P<0.05），贝复济组含量明显上调（P<0.05）、石香膏组的AGEs的含量明显下调（P<0.05）。与阳性对照组比较，各给药组AGEs的含量下调（P<0.05）;与石香膏组比较，贝复济组的AGEs含量上调P<0.05）。14天时间点的样本，与正常组对比，阳性对照组、贝复济组、石香膏组的AGEs的含量明显上调（P<0.05），与阳性对照组比较，各给药组AGEs的含量下调（P<0.05），与石香膏组比较，贝复济组的AGEs含量上调（P<0.05）结果见表1，图1一图8。

3.2.2各组大鼠背部创面肉芽组织中VEGF的含量：在7天与14天时间点的样本与正常对照组对比，阳性对照组含量下调（P<0.05），贝复济组、石香膏组VEGF的含量明显上调（P<0.05），与阳性对照组比较，各给药组的明显含量上调（P<0.05）;与石香膏组比较，贝复济组的VEGF含量下调（P<0.05）。结果见表2，图8-图16。

3.2.3各组大鼠背部创面肉芽组织中CD34的含量：在7天与14天时间点的样本与正常对照组对比，阳性对照组含量下调（P<0.05），贝复济组、石香膏组CD34的含量明显上调（P<0.05），与阳性对照组比较，各给药组的明显含量上调P<0.05）;与石香膏组比较，贝复济组的CD34含量下调（P<0.05L结果见表3，图17-图24。

4讨论与结论

4.1讨论

糖尿病溃疡属于的祖国医学中“痈疽”。“痈疽”的病机为脏腑出现功能障碍及某些致病的因素侵袭人体，造成邪毒滞的留滞，从而导致气血聚集不流通，最后出现瘀血凝滞而肌肉、气血腐坏。病机以热瘀为主《黄帝内经》所云：“营气不从，逆于腠理，乃生痈肿”。对“痈疽”的治疗及理论研究经过长期的实践与探索，从而形成了“提脓祛腐”和“煨脓长肉”的创新性理论体系。前者正是依据《灵枢.痈疽》日：“肉腐则为依据，腐不去则新肉不生”的理论，对于腐肉缓慢的不脱或脱从而影响到新肉的生长恢复，采用如丹类具有提脓祛腐的药物，使疮疡中积蓄不畅的脓毒可以早日排出，使腐肉得以快速脱落，称为追蚀法。此治疗法重点在于“腐”，排出腐、脓等有形之邪为首要目的，如邪不去，则易生热，热生则肉腐，肉腐转化为脓，疮疡于是经久难愈。后者是指在疮疡愈合的腐去肌生和肌平皮长阶段，外用中药的膏（散）剂，目的让药物经过皮肤以及疮面吸收，促进局部气血运行使其通畅，增强疮疡处抗病能力，目的使疮口渗出较多的脓液，以此保持疮面的湿润，起到调节患处气血，促进局部组织快速生长，减少瘢痕的作用。疮面愈合后期的脓之来必由气血，故为局部气血旺盛正常产生的代谢产物，以此可理解为：“偎者，用法温也，脓者，实为气血也。”是指温经通络使局部气血旺盛，达到疮口渗出增多以保持疮面湿润的目的，重点在于强调温度和湿度对创面修复愈合的重要。

4.1.1中药“石香膏”的方组及现代药理学研究

中药“石香膏”是由乳香、没藥、赤石脂、栀子等药物调制而成。方中乳香、没药均能活血定痛，消肿生肌，在近年广泛运用含乳香、没药方剂当中，其中生肌散用于局部外敷治疗疮疡临床疗效显著，化腐止痛以及生肌收口效果良好。同时对于重度褥疮的治疗，其效果显著优于常规的褥疮治法，明显起到了加快创面愈合以及促进组织修复的作用。赤石脂的功效在于止血生肌，并能收湿敛疮;栀子清热利湿，凉血解毒;已有因促进溃疡面愈合作用而运用赤石脂的溃疡散在治疗深部脓肿、手足部化脓性感染，、下肢慢性溃疡等，取得了促进溃疡愈合的满意疗。

4.1.2糖尿病溃疡的现代医学治疗

创面修复是一个包括凝血过程、组织增殖等一系类复杂过程。包括再生、修复、重建，对患处进行修补。糖尿病患者因为长期处于高血糖状态下，易生成AGEs（Advancedglycation end products，糖基化终末产物），此物质为体内蛋白在非酶糖化和氧化反应下与还原糖结合形成的结构，对创面愈合有抑制作用。由于AGEs在各种细胞中的积累，细胞结构和功能可能会随着RAGE的参与而变化。

4.1.3糖尿病溃疡的已经开展的中西医治疗

糖尿病溃疡的创面修复在以往的清创、清除感染、物理方法如减压以及中医药治疗等基础上，近年有大量新技术的应用。其中典型的新技术是干细胞治疗，理论依据是利用于细胞有利于创面修复的自我分化、更新、繁殖能力，干细胞因其在血液循环丰富部位的特殊作用有利于创面修复。还能不断促进有利于组织修复的细胞增殖。因其在创面组织中可以分泌转化生长因子-β、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子等对于创面的修复有中药促进作用。同样干细胞治疗技术目前也还存在一些缺陷。其机制不明确，且安全性还未得到足够完善的验证。

中医药在近些对于糖尿病溃疡也通过丰富的治疗手段，取得了不错的疗效。膏药外敷治方面，陈娜使用回阳生肌膏外敷患处治疗慢性皮肤溃疡患者，治疗总有效率达到85.0%。湿性外敷治疗，苑海刚等用蓬子菜水溶液喷洒于糖尿病溃疡患者的下肢皮肤溃疡处，取得了不错的效果。足浴疗法治疗，指运用温热药物侵泡足、腿，使身体毛细血管得到扩张来促进足部吸收药物，加速创面愈合合。吴之平等用自拟方汤剂对糖尿病溃疡患者进行足浴，得到了显著的疗效。熏洗疗法，一种通过中医整体理论，利用煎煮药物后所形成的富含药物成分的蒸汽来熏蒸患者达到治疗目的方法。

中药石香膏正是通过大量临床使用，得到良好效果的中医药治疗方法之一。

4.2关于实验观察指标

晚期糖基化终末产物即AGEs在糖尿病的整体过程中有着重要的影响，已是糖尿病确诊的重要敏感标志物，近年相关的作用机制的研究以及相关的干预药物的研究已经广泛的开展，成为热点之一。有研究表明，AGES具有不可逆性，其机制主要是在机体的高血糖状态下，体内蛋白质等生物大分子在非酶条件下与葡萄糖或其他还原单糖反应所生成的稳定的糖基化终末产物。糖基化终末产物增多可破坏神经细胞，使其变性甚至坏死以至降低神经传导速。AGEs除了是糖尿病之外，还是诸多慢性疾病如阿兹海默病、肿瘤的主要致病机制。而目前与糖尿病溃疡较为紧密的研究，指向了糖尿病患者晚期因糖基化终末产物水平升高，阻碍了内皮细胞和白细胞的相互作用，干扰了细胞因子的分泌，减少内皮细胞增殖从而诱导其调亡，并且降低碱性成纤维细胞生长因子促有丝分裂的活性，降低成纤维细胞合成胶原的能力。

由表1可知7天的样本，与正常对照组对比，阳性对照组含量明显上调，说明AGEs确实较多存在于阳性对照组的创面，而贝复济组含量明显上调与石香膏组的AGEs的含量明显下调说明在两者和正常组对比，石香膏更能明显降低AGEs含量。与阳性对照组比较，各给药组AGEs的表达下调，说明石香膏与贝复济药物的应用均能对AGEs增多起到抑制作用;而与石香膏组比较，贝复济组的AGEs表达上调，说明在抑制AGEs方面石香膏对比贝复济有着更好的效果。14天时间点的样本的对比，正常对照组的AGEs含量明显低于其他组，说明与正常创面对比，糖尿病溃疡状态下AGEs会增多。而糖尿病溃疡三组的对比关系与7天时无差异。整体的对比说明了石香膏在治疗糖尿病溃疡抑制AGEs方面起到了明显的作用。

血管内皮生长因子即VEGF，VEGF是作为促血管生成因子目前发现唯一能对于血管内皮细胞起到特异性作用的，其具体作用包括直接增加血管通透性，并且刺激血管内皮细胞的分裂与增殖;促进血管形成。创面的血管新生为创面肉芽组织形成提供了必要的氧气以及营养物质，保证了整个修复的良好持续。在慢性难愈合创面中很大可能的重要病理机制就是血管新生受限。相关研究也一直在广泛开展。通过多种路径激活VGEF的作用，从而促进血管新生，是近年在创面修复中研究较多的课题。由表2可知，在7天与14天时间点的样本与正常对照组对比，阳性对照组含量下调表示糖尿病溃疡创面相较正常创面VEGF明显较少，修复能力变差。贝复济组、石香膏组与正常对照组以及阳性对照组相比VEGF的含量明显上调表示使用两组药物有促进VGEF因子增多的效果。而与石香膏组比较，贝复济组的VEGF表达下调表示石香膏有着更强的促进VGEF增多作用，在糖尿病溃疡创面的治疗上有着更好的效果。

CD-34是高度糖基化I型跨膜糖蛋白，作为黏蛋白样血管递质素的一种，可以根据检测创面CD34表达作为新生血管形成的标记。其相对分子质量为110000，其强阳性表达在血管内皮细胞以及造血干细胞和骨髓基质细胞，其均对血管生成有重要作用。同时，还作为血管内皮细胞的表面特异性标志物，对于创面愈合中有着重要意义，因此检测CD34的含量可用于反映肉芽组织中新生血管情况，直接影响到创面的愈合。根据国外研究显示，CD34+造血干细胞对于缺血组织及器官功能有着极大的改善作用。如表3，在7天与14天时间点的样本与正常对照组对比，阳性对照组含量下调表示在糖尿病溃疡状态下CD34会减少，意味着新生血管减少，不利于创面恢复。贝复济组、石香膏组与正常组及阳性对照组比较CD34的明显上调意味着两种药物都会CD34有促进的作用，可理解为更有利于创面组织的新生血管。与石香膏组比较，贝复济组的CD34表达下调说明石香膏更能促进CD34增多，表示了窗口新生血管较多，可理解在创面愈合方面有着更好的作用。

本次试验观察到石香膏对对于糖尿病溃疡的治疗能够明显抑制AGEs，并促进VEGF、CD34表达上调;根据实验得出相关结果，以及近年广泛的理论研究，其治疗糖尿病溃疡可以更好的促进创面愈合。