血府逐瘀汤对冠心病模型大鼠血管及心肌细胞凋亡的影响

常冰 李昌

摘要 目的：觀察血府逐瘀汤对冠心病模型大鼠的血管重塑效应及对心肌细胞凋亡的影响。方法：将30只SD大鼠随机分为空白组、模型组及干预组，每组10只。模型组及干预组大鼠接受高脂饲料喂养7周以制备冠心病模型，造模后中药干预组大鼠接受血府逐瘀汤灌胃，模型组及空白组大鼠接受等剂量生理盐水灌胃，连续灌胃4周，干预结束后测量3组大鼠心功能及冠状动脉血流量，随后将大鼠处死后取冠状动脉及左心室组织，进行HE染色观察冠状动脉及左心室组织的病理学变化。采用Western blotting法测定PI3K、AKT、Bcl-2、Bax的表达差异。结果：1）与空白组比较，模型组LVSP、-dp/dtmax、+dp/dtmax绝对值明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），其中干预组上述指标较模型组高;2）与假手术大鼠心肌组织比较，模型组及干预组大鼠左心室心肌均出现明显的病理损害征象;与模型组大鼠比较，干预组心肌组织受损程度明显减轻;与空白组比较，模型组及干预组大鼠冠状动脉内中膜均出现明显增厚，经过血府逐瘀汤干预后的干预组大鼠动脉内中膜厚度比值明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;3）Western blotting法检测结果显示：与空白组比较，2组接受造模的大鼠心肌组织PI3K、Bcl-2表达降低，Bax升高，血府逐瘀汤可上调PI3K及AKT的磷酸化程度，提高了Bcl-2表达，抑制了Bax的水平。结论：血府逐瘀汤有抑制冠心病模型大鼠血管重塑及保护心脏的效应，其作用机制可能与介导PI3K-AKT信号通路有关。

关键词 冠心病模型;大鼠;血管重塑;心肌保护;凋亡;PI3K-AKT信号通路;作用机制

Abstract Objective：To observe the effects of Xuefu Zhuyu Decoction on vascular remodeling and cardiomyocyte apoptosis in coronary heart disease model rats.Methods：A total of 30 SD rats were randomly divided into sham operation group，model group and intervention group，with 10 rats in each group.Rats in the model group and intervention group were fed with high-fat diet for 7 weeks to prepare coronary heart disease model.Rats in the intervention group received Xuefu Zhuyu Decoction by gavage.Rats in the model group and the sham operation group received the same dose of normal saline by gavage for 4 weeks.After the intervention，cardiac function and coronary blood flow were measured in each group of rats，and the coronary artery and left ventricular tissue were taken after the rats were killed.Pathological changes of the coronary artery and left ventricular tissue were observed by HE staining.Expressions of PI3K，AKT，Bcl-2 and Bax were detected by Western blotting.Results： 1）Compared with the sham operation group，the absolute values of LVSP，-dp/dtmax and+dp/dtmax in the model group were decreased obviously，with statistical significance（P<0.05），in which the above indexes in the intervention group were up-regulated compared with those in the model group. 2）The left ventricular myocardium in the model group and the intervention group showed obvious pathological changes compared with that in the sham operation group.Compared with the model group，the damage degree of myocardial tissue in the intervention group was significantly reduced; compared with the sham operation group，the intima-media thickness of coronary artery in the model group and the intervention group was significantly thickened.After the intervention of Xuefu Zhuyu Decoction，the ratio of intima-media thickness of the artery in the intervention group was significantly lower than that in the model group，and the difference was statistically significant（P<0.05）. 3）Western blotting showed：compared with the sham operation group，the expressions of PI3K and Bcl-2 in the myocardial tissue of rats in the other 2 groups underwent modeling were decreased，while the expression of Bax was increased.Xuefu Zhuyu Decoction could up-regulate the phosphorylation of PI3K and AKT，up-regulate the expression of Bcl-2，and inhibit the level of Bax.Conclusion：Xuefu Zhuyu Decoction has the effect of inhibiting vascular remodeling and protecting the heart in coronary heart disease model rats，and its mechanism may be related to mediating the PI3K-AKT signaling pathway.

Key Words Coronary heart disease model; Rat; Vascular remodeling; Myocardial protection; Apoptosis; PI3K-AKT signaling pathway; Mechanism

中图分类号：R542.2;R965.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.019

冠心病（Coronary Heart Disease，CHD）指的是冠状动脉粥样硬化后导致冠脉管腔狭窄以及顺应性改变，导致冠状动脉供血不足，由此引起心肌缺血、缺氧改变的心脏疾患。有研究表明磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase/protein Kinase B，PI3K-AKT）信号通路对心肌细胞的存活及功能有重要调控效应，通过调控血管平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡等途径影响CHD的进程，其中凋亡是最关键环节。CHD属于中医学“胸痹”“真心痛”的范畴，认为气滞、寒凝、痰瘀、虚损是重要病因，其中心血瘀阻是重要证型，故活血化瘀，祛瘀止痛是重要治则[1-3]。血府逐瘀汤具有活血化瘀、行气止痛的作用，临床不乏其有效治疗CHD的报道[4-7]，但其作用机制目前尚无统一定论，基于此我们利用CHD大鼠模型，深入研究血府逐瘀汤的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 30只雄性SD大鼠，购买自济南金丰实验动物有限公司（许可证号：SCXK（鲁）2014 0006），所有动物均饲养于本院动物实验中心，饲养环境设置如下：温度（23±1.5）℃，湿度（51±1.5）%，12 h/12 h光暗周期。

1.1.2 药物 血府逐瘀汤由本院中药研究院提供，中药组成：川芎15 g、生地黄12 g、桔梗6 g、柴胡9 g、当归9 g、赤芍9 g、川牛膝12 g、桃仁9 g、红花9 g、甘草6 g。

1.1.3 试剂与仪器 PI3K一抗抗体（Abcam有限公司，货号ab32089）、AKT（Abcam有限公司，货号：ab8805）、Bax（Abcam有限公司，货号：ab32503）、Bcl-2（Abcam有限公司，货号：ab32124）、β-actin一抗抗体（Abcam有限公司，货号ab8226）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天公司），ECL显影试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

1.2.1.1 分组 采用数字随机法将30只SD大鼠分为空白组、模型组及干预组，每组10只。3组大鼠在体质量、鼠龄各方面比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2.1.2 模型制备 空白组大鼠接受普通饲料饲养，模型组及干预组大鼠接受高脂饲养喂养，高脂饲料配制如下：胆固醇∶猪油∶丙硫氧嘧啶∶基础饲料=4∶10∶0.2∶86的比例配置，模型组和干预组在接受高脂饲料喂养的同时灌胃10 mL/（kg·d）脂肪乳剂（脂肪乳剂配制方法：猪油20 g溶化后，加胆固醇10 g，胆酸钠2 g，甲基丙硫氧嘧啶1 g，搅匀，加入20 mL吐温-80，蒸馏加至100 mL充分混匀，即成，用时以37 ℃水浴融化），连续喂养7周[8]。

1.2.2 干预方法 造模后干预组大鼠接受血府逐瘀汤灌胃，按大鼠与人体间等效剂量换算成1.32 g/mL，每日灌胃1次，空白组及模型组大鼠接受等剂量的生理盐水灌胃，3组均连续灌胃4周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 心功能及冠状动脉血流量 干预结束后对3组大鼠经房室插入球囊，连接压力换能器，将所得数据传输至计算机，计算出左心室收缩压（LVSP）、左室内压最大变化速率（±dp/dtmax），同时对冠状动脉血流量进行测定。

1.2.3.2 冠状动脉及左心室组织HE染色 从各组中随机选取3只大鼠，取出冠状动脉及左心室组织，将所获组织置于10%多聚甲醛固定24 h，随后取出组织进行脱水，步骤如下：二甲苯（Ⅰ）15 min-二甲苯（Ⅱ）15 min-无水乙醇12 min-无水乙醇5 min-80%乙醇8 min-蒸馏水5 min，随后将组织进行石蜡包埋，切片后中性树胶封固，苏木精液染色5 min，清水冲洗3 min，显微镜下观察并进行图像采集。

1.2.3.3 Western blotting法测定PI3K、AKT、Bcl-2、Bax的表达差异 从各组中随机选取3只大鼠，取出左心室组织称重后以1∶100比例加入适量蛋白裂解液，静置10 min后将组织置于离心机15 000 r/min离心10 min，取出上清液后用BCA试剂盒测定各样本蛋白含量，根据计算的上样量将各样本加入至电泳凝胶，电泳结束后将目的蛋白转膜至PVDF膜，随后将PVDF膜清洗干净后加入事先配制好的脱脂蛋白，封闭2 h后使用TBST洗涤，共3次，5 min/次，随后加入稀释后的一抗（抗体：稀释液=1∶1 000），孵育24 h后取出生物膜，再用TBST洗涤，共3次，5 min/次，加入二抗孵育1 h后随后加入显影液，在凝胶成像系统中进行化学发光显影、采集及观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，对数据进行正态分布检测，符合正态分布采用t检验，不符合正态分布采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 結果

2.1 3组心功能及冠状动脉血流量比较 与空白组比较，模型组和干预组的LVSP、-dp/dtmax、+dp/dtmax、CF绝对值明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），其中干预组上述指标较模型组高，2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 3组HE染色结果比较 与空白组比较，模型组及干预组大鼠冠状动脉内中膜均出现明显增厚，经过血府逐瘀汤干预后干预组大鼠动脉内中膜厚度比值明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2、图1。左心室组织HE染色：空白组大鼠心肌细胞排列齐整，细胞膜完整，心肌细胞饱满，胞质着色均匀，心肌间质无水肿等病理征象。模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，部分出现纤维化，心肌间质伴随明显的水肿及炎性细胞浸润，并出现多发的灶状的空泡变性。干预组大鼠部分心肌组织也存在纤维化现象，但程度较模型组减轻，心肌间质有少量炎性细胞浸润，轻度水肿，少量灶状的空泡变性。见图2。

2.3 3组Western blotting法检测结果比较 与空白组比较，2组接受造模的大鼠心肌组织PI3K、Bcl-2表达降低，Bax升高，血府逐瘀汤提高了PI3K及AKT的磷酸化程度，上调了Bcl-2表达，抑制了Bax的水平。见图3。

3 讨论

CHD的发生发展与高脂血症有紧密的关系，脂质长时间沉积于血液中，不断刺激动脉血管内膜，导致结缔组织增生而引起冠脉管腔狭窄和冠脉痉挛性改变，导致心肌组织缺血缺氧，从而出现本病。故本研究参照诸多文献[9-11]后通过饲养高脂饲料、灌胃脂肪乳制备CHD模型。CHD属于中医学“胸痹”“真心痛”等范畴，根据其临床表现可分为寒凝心脉证、心血瘀阻证、气滞心胸证、痰浊阻滞证等，其中瘀阻心脉是临床发病率最高的证型，多数CDH患者年事已高，且病程日久，久病体虚，气血阴阳亏虚，无法濡养，不荣则痛，加之痰浊、寒凝、气滞心脉，病邪壅堵其中，不通则痛，虚以气虚为基础，实则以瘀血为常见。气为血帅，气行则血行，气虚无法顺利推动血行，血运迟缓而留滞为瘀，而瘀滞于心脉，导致气血运行失衡诱发本病。血府逐瘀汤源自王清任《医林改错》，川芎、赤芍、生地黄、当归、桃仁、红花、牛膝、枳壳、桔梗、柴胡及甘草是本方主要药物，被视为活血化瘀法的經典方剂。方中桃仁破血化瘀散滞，亦可润燥，红花有活血化瘀以止痛，二药共为君药。桃仁性味苦平，主要入心经、肝经以及大肠经，在祛瘀生新的基础上有润肠通便之功，现代药理研究显示桃仁提取物有扩张血管降低血行阻力的作用，并可降低血液黏稠度;红花性温味辛，主要入心经及肝经，临床大量研究证实红花主要成分红花黄色素可明显改善CHD发作时引发的心绞痛症状，药理研究[12-13]发现其具有抗血栓形成、降低心肌细胞兴奋性、抗凝、扩张血管等作用，故可明显改善心脉瘀滞，促进血运。川芎可加强君药的活血化瘀之功，气为血帅，气行则血行，血行则诸瘀自除。其主要成分川芎嗪可催化血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶活性，对维持血管稳态有明显作用，抑制CHD机体血管内皮炎性效应。赤芍性寒味苦，可活血化瘀、凉血消肿止痛，可缓解不通而痛的病症，与川芎合用共奏活血化瘀祛瘀之功。牛膝可引血下行，经通则痛止，将郁结于胸中的瘀血引行于下，条畅上焦气机。川芎、赤芍、牛膝三药合用共为臣药。柴胡有疏肝解郁，畅达清阳之功，可通过调畅气机治疗气滞导致的胸闷、胸痛之症。桔梗与枳壳同用，一升一降，气顺则郁解[14-15]。当归有补血活血的作用，可双向调节心肌平滑肌，其药理成分是生物活碱。此外当归主要成分阿魏酸具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羟色胺释放，抑制血小板血栓素a2（txa2）的生成，增强镇痛，缓解血管痉挛等作用，是生产用于治疗心血管疾病药品的基本原料[16-17]。生地黄有清热凉血之功，亦可养阴生津，有祛瘀不伤血之功，甘草以缓解诸药药性，亦可缓解止痛。诸药合用即可条畅全身气机，又可消除局部血瘀[15-16]。本研究结果显示与空白组比较，模型组LVSP、-dp/dtmax、+dp/dtmax、CF绝对值明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），其中干预组上述指标较模型组上调，这说明血府逐瘀汤有改善CDH模型大鼠的心功能和血供。同时我们证实血府逐瘀汤可明显改善心肌组织的病理形态，通过抑制大鼠动脉内中膜厚度增强冠脉血液灌流量。

细胞凋亡是程序性细胞死亡，诸多促细胞凋亡及抑制细胞凋亡的蛋白参与其中。PI3K-Akt信号通路是目前备受关注的与凋亡关系密切的信号通路[18-19]，其中Akt磷酸化后可进一步诱导Bad磷酸化，当Bad磷酸化后结合细胞质抗凋亡蛋白14-3-3，将Bcl/Bad复合物中的Bcl-2解除出来，从而引发抗凋亡作用。此外Akt可直接磷酸化叉头转录因子而抑制细胞凋亡。细胞色素C从线粒体膜间隙的释放，在细胞的凋亡早期阶段，被磷酸化的Akt可抑制细胞色素C转移至细胞质内，阻断细胞异常凋亡程序进行[20-21]。与空白组比较，2组接受造模的大鼠心肌组织PI3K、Bcl-2表达降低，Bax升高，血府逐瘀汤可上调PI3K及AKT的磷酸化程度，上调了Bcl-2表达，抑制了Bax的水平，由此证明血府逐瘀汤可通过介导PI3K-Akt信号通路而发挥作用。

综上所述，血府逐瘀汤有抑制CHD模型大鼠血管重塑及保护心脏的效应，其作用机制可能与介导PI3K-AKT信号通路有关。

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（2018-10-30收稿 责任编辑：王杨）