基于效液相色谱法测定参附注射液中人参皂苷的浓度

罗宇文 杨亦炳 王文娟

摘要 目的：評价高效液相色谱法（HPLC）指纹图检测方法测试参附注射液中人参皂苷的浓度。方法：采用Agilengt-1100高效液相色谱仪进行试验研究，色谱柱选用Agilent的ZORBAX SB-C18柱，具体参数为5 μm×250 mm×4.6 mm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，选择流动相的条件是在A流动相水和B流动相乙腈中以1 mL/min的流速进行HPLC研究。分别对HPLC方法学的严谨性进行检测，包括专属性试验、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、线性回归试验、加样回收率试验等逐步建立方法的科学性;而后进一步采用HPLC对参附注射液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的浓度进行具体的检测和统计分析。结果：专属性结果显示4种人参皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rd）均具有良好的分离度，拖尾因子均在0.98～1.04范围。线性回归方程：人参皂苷Rg1为Y=11 278X-54.71，人参皂苷Re为Y=3 633X-36.34，人参皂苷Rb1为Y=8 640X-4.18，人参皂苷Rd为Y=7 088X+35.03，所有人参皂苷相关系数均>0.999，结果显示人参皂苷线性关系良好。人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd峰面积的RSD分别为1.23%、1.28%、1.33%、1.20%、1.35%，结果表明HPLC具有良好的精密度。人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的峰面积RSD分别为0.44%、0.75%、0.25%、0.85%;结果表明参附注射液供试品溶液在24 h内稳定。人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的RSD分别为1.18%、1.47%、1.86%、1.59%、1.30%，结果显示HPLC具有良好的重复性。加样回收率，人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的RSD分别为1.82%、1.04%、1.54%、2.07%，结果显示加样回收率均良好。不同批次参附注射液中人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的浓度存在较大差别。结论：高效液相色谱法检测不同批次参附注射液中人参皂苷的浓度存在较大差异。

关键词 高效液相色谱法;参附注射;线性回归方程;加样回收率;人参皂苷Rg1;人参皂苷Re;人参皂苷Rb1;人参皂苷Rd

Abstract Objective：To test the concentration of ginsenoside in Shenfu Injection by high performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：The Agilengt-1100 HLPC was used in this study.ZORBAX SB-C18 column of the Agilent was selected as the chromatographic column，whose specific parameter was 5 μm × 250 mm × 4.6 mm，the column temperature was 30 ℃ and the sample volume was 10 μL.The condition of selecting the mobile phase was to study at the 1 mL/min velocity in the A flow phase water and the B flow phase acetonitrile.The rigor of the HPLC methodology was tested respectively.The scientificity of the method was gradually established by steps such as specificity test，precision test，stability test，repeatability test，linear regression test，sample recovery test and so on.Then the HPLC was used to perform specific detection and statistical analysis of the concentrations of ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1 and ginsenoside Rd in the Shenfu Injection.Results： 1）The specificity outcome showed that the separation degrees of ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1 and ginsenoside Rd were good.Their tailing factors were within the range of 0.98-1.04.The results showed that the HPLC method in the study of detecting the concentration of ginsenoside in the Shenfu Injection was of good specificity. 2）Linear regression equation：ginsenoside Rg1′s was Y=11 278X-54.71; ginsenoside Re′s was Y=3 633X-36.34; ginsenoside Rb1′s was Y=8 640X-4.18; and ginsenoside Rd′s was Y=7 088X+35.03.All the correlation coefficients of the ginsenosides were higher than 0.999，and the results showed that the linear relationship of the ginsenoside was good. 3）The RSD of peak area of ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd were 1.23%，1.28%，1.33%，1.20% and 1.35% respectively.The results showed that the HPLC instrument had good precision.The RSD of peak area of ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd were 0.44%，0.75%，0.25% and 0.85% respectively.The test results showed that the sample solution of Shenfu Injection was stable within 24 hours.The RSD of ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd were 1.18%，1.47%，1.86%，1.59% and 1.30% respectively.The results showed that the HPLC method had good repeatability. 4）The HPLC was used for determining the sample recovery rate，and the results showed that the RSD of ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd were 1.82%，1.04%，1.54% and 2.07% respectively，which showed that the sample recovery rate was good. 5）The concentrations of ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd in different batches of Shenfu Injection were quite different.Conclusion：The concentration of ginsenoside determined by HPLC in Shenfu Injection of different batches is quite different.

Key Words High performance liquid phase; Shenfu Injection; Linear regression equation; Sample recovery rate; Ginsenoside Rg1; Ginsenoside Re; Ginsenoside Rb1; Ginsenoside Rd

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.012

参附注射液源于古方“参附汤”，原方由红参、附子两味中药组成为一种常用的急救药物，在中医药理论指导下主治元气大亏，阳气暴脱等急症。随着中药制剂的改革，参附注射液随之问世并广泛运用于临床，目前临床多用于心力衰竭类型的疾病[1-3]，用于增强心脏收缩功能和抗心力衰竭。有研究显示，参附注射液中的有效成分之一是人参皂苷，人参皂苷按皂苷元的不同類型可分为两类，即原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷，其中根据含量的高低原人参二醇型皂苷的亚型Rb1、Rd等[4-5]，原人参三醇型皂苷的亚型根据含量高低排序依次为Re、Rg1等。而近年来，人参皂苷显著的药理活性越来越被人们所熟知，研究报道显示，人参皂苷Rh2、Rg3和Rk1均具有抗肿瘤的药理活性[6-9]，人参皂苷Rg3具有神经保护作用，改善脑缺血损伤，人参皂苷Rg3、Rg5和Rk1具有羟自由基清除能力和抗炎等药理作用。本研究为完善参附注射液的质量控制体系，基于高效液相色谱法（HPLC）测定参附注射液中人参皂苷浓度，具体选取原人参二醇型中皂苷含量较高的人参皂苷Rb1、Rd和原人参三醇型皂苷种含量较高的人参皂苷Rg1、Re等共4种人参皂苷成分进行分析研究。现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent高效液相色谱仪（产品型号：1260），色谱柱采用同色谱仪同厂家的匹配型号ZORBAX SB-C18柱，色谱仪产品配件：四元梯度泵，单元是DAD多波长检测器，Agilent系列产品均购于美国Agilent Techologies公司;精密BS210S型电子天平购于德国Sartorius公司。

1.2 试剂 对照品人参皂苷Rb1对照品（产品批号：110704-20092）、人参皂苷Rd对照品（产品批号：111818-201302）、人参皂苷Rg1对照品（产品批号：110703-201027）、人参皂苷Re对照品（产品批号：110754-200822）均购于中国食品药品检定研究院。色谱纯乙腈，去离子水和分析纯均购买于湖北杜克化学科技有限公司。

1.3 分析样品 3个不同批次的参附注射液（国药准字Z51020664）购于华润三九（雅安）药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilengt-1100高效液相色谱仪进行试验研究，色谱柱选用Agilent的ZORBAX SB-C18柱，具体参数为5 μm×250 mm×4.6 mm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，以水和乙腈（以下分别称之为流动相A和流动相B）作为本次研究的流动相的条件，并以1 mL/min的流速开展参附注射液的HPLC人参皂苷浓度研究，根据高效液相色谱法（HPLC）的梯度洗脱程序进行试验。见表1。在这个色谱条件下获得参附注射液样品HPLC图谱（图1）和混合对照品HPLC图谱（图2）。

2.2 对照品溶液的制备

所有人参皂苷均由中国食品药品检定研究院检测合格后提供，在对照品溶液的制备中，首先将中国食品药品检定研究院提供的4种人参皂苷对照品（即人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rd对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品）进行精密称取，分别放于对应名称的含有甲醇容量瓶中，待各种人参皂苷对照品充分溶解后，再取一个干燥的容量瓶对4种人参皂苷对照品进行混合，由此获得混合人参皂苷对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

分别从3个不同生产批次的参附注射液中取出适量待测样品，将其编号为001、002、003，再将待测样品置于0.22 μm的微孔滤膜进行过滤，最终获得参附注射液供试品溶液。

2.4 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液及供试品溶液10 μL，按“2.1”项色谱条件进行HPLC检测，结果显示4种人参皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rd）均具有良好的分离度，拖尾因子均在0.98～1.04范围内，说明本实验采用HPLC检测参附注射液中人参皂苷浓度的研究具有良好的专属性。

2.5线性关系考察：4种人参皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rd）均取适量，并根据由低到高的浓度梯度，每种人参皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rd）均制备5种不同的质量浓度，其中人参皂苷Rg1的质量浓度为31.72、63.44、95.16、126.88、158.60 μg/mL;人参皂苷Re的质量浓度为11.43、22.86、34.29、45.72、57.15 μg/mL;人参皂苷Rb1的质量浓度为129.87、259.74、389.61、519.48、649.35 μg/mL;人参皂苷Rd的质量浓度为18.71、37.42、56.13、74.84、93.55 μg/mL;随后将4种人参皂苷根据从低到高的浓度分别混合获得5种质量浓度的人参皂苷混合对照品溶液，分别编号1-5并连续进样，进样量10 μL，以峰面积为纵坐标Y轴，对照品质量浓度为横坐标X轴，绘制标准曲线进行线性回归，计算各个人参皂苷的回归方程、相关系数。结果详见表2。提示人参皂苷的线性关系良好。

2.6 精密度试验

精密度试验采用的是人参皂苷混合对照品溶液，每次进样均取10 μL，连续进样6次，根据色谱条件检测并记录所有色谱峰的峰面积，计算RSD值，本研究结果显示4种人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd根据峰面积计算的RSD分别为1.23%、1.28%、1.33%、1.20%、1.35%，结果表明HPLC仪器具有良好的精密度。

2.7 供试品溶液稳定性试验

为了检测参附注射液样品在24 h内的稳定性，将其室温放置，准备7份容器并标明时间点，分别为0、1、2、3、6、12、24 h，根据时间的先后顺序进行HPLC检测，记录参附注射液中人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的峰面积，本研究结果显示：人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的峰面积RSD分别为0.44%、0.75%、0.25%、0.85%;本研究结果表明，参附注射液供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 重复性试验

重复性试验的检测样品是参附注射液供试品溶液，需要严格取同一个批次的参附注射液，分成6份进行HPCL检测，计算各物质的质量浓度，人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的平均质量浓度分别为51.73、22.33、156.85、140.36 μg/mL，人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的RSD分别为1.18%、1.47%、1.86%、1.59%、1.30%，结果显示HPLC和参附注射液均具有良好的重复性。

2.9 加样回收率试验

加样回收试验需要同时精密量取0.12、0.20、0.28 mL的混合对照品溶液和参附注射液供试品溶液，通过HPLC检测已知浓度样品和对照品进行比较并计算平均回收率，结果显示人参皂苷的加样回收率良好，具有较好的准确度。具体见表3。

2.10 样品测定结果

不同批次参附注射液中人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的浓度存在较大差别。见表4。

3 讨论

参附注射液作为急救药物，在临床中的应用越来越广泛，它主要针对阳气暴脱症和阳虚所致的惊悸、怔忡等急性病症。目前关于参附注射液的药理研究众多，如抗心力衰竭[10]、保护缺血再灌注损伤[11]和抗休克[12]等，但至今为止对参附注射液有关其化学成分、成分浓度分析等的研究鲜见报道。近年来中药注射剂的不良反应报道屡见不鲜[13]，目前有很多的因素影响着中药注射剂的安全性和有效性，除了讨论最多的制备工艺这一影响因素外，还有中药注射剂质量的评估标准，再到具体发挥药效的物质等各种影响环节[14]。因此为保证参附注射劑的临床疗效，不应拘泥于单一成分、单一指标，而应着眼于多成分多指标，对药物产品进行全方位的质量评价，以确保参附注射液的药效物质基础，也为保证参附注射液的用药安全提供科学依据。我们主要研究参附注射液中的人参皂苷这以药效物质，关于人参皂苷的分离、纯化的研究早在20世纪60年代就有文献[15-16]报道，详细阐述了人参皂苷的水解过程以及水解后得到的产物化学结构。研究人员在前人的基础上，进一步提取人参中的人参皂苷，采用薄层层析分析并命名获得的人参皂苷各个亚型，命名原则根据薄层层析所得Rf值大小命名子成分。而本研究选择了4种含量较高的人参皂苷成分进行分析研究，这4种人参皂苷的Rf值由小到大的顺序依次为Rb1、Rd、Re、Rg1[17-18];其中人参皂苷Rb1、Rd属于原人参二醇型，而人参皂苷Rg1、Re属于原人参三醇型皂苷[19]。

在参附注射液中人参皂苷的Rg1、Re、Rb1和Rd等4种亚型浓度的检测工作中发现，采用可见紫外分光分光度法仅对总人参皂苷浓度的检测敏感度较高，而对Rg1、Re、Rb1和Rd等4种亚型的敏感性较低，因此未采取该法测定参附注射液中的人参皂苷浓度;而薄层扫描法（TLCS）操作步骤相对较复杂，实验过程中对外界条件要求较高，反而一定程度影响Rg1、Re、Rb1和Rd等4种亚型的敏感性;而在HPLC的操作过程中，方法简便易行，系统较封闭，分离过程不易受外界影响，在方法严谨性考察中，专属性、精密度、稳定性和重复性均良好，这充分显示了HPLC检测法的高效能、高敏度及高广度的应用特点。鉴于此我们选用HPLC作为主要检测手段，并结合线性回归方程对参附注射液在某一个浓度或峰高（面积）条件的样品成分进行测定，检测其是否符合紫外检测器的朗伯比尔定律。本研究结果显示，线性回归方程：人参皂苷Rg1为Y=11 278X-54.71，人参皂苷Re为Y=3 633X-36.34，人参皂苷Rb1为Y=8 640X-4.18，人参皂苷Rd为Y=7 088X+35.03，所有人参皂苷相关系数均>0.999，说明人参皂苷线性关系良好;而参附注射液的加样回收试验结果显示人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的RSD分别为1.82%、1.04%、1.54%、2.07%，说明人参皂苷的加样回收率均良好，与其他参附注射液的相关HPLC研究的加样回收率的结果一致[20]。本研究关于流动相的试验性探索中，在Agilent ZORBAX SB-C18柱中，对比甲醇-水和乙腈-水这2种流动相的差异，本研究通过对比发现，当乙腈-水作为流动相时，HPLC用最少的分析时间得到的人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd分析图中的峰形具有最高的分离度、最低的干扰度，其峰形的基线噪声也是最低的。HPLC试验过程中，经二极管阵列检测器进行紫外光谱扫描，比较了202 nm波长和203 nm波长对人参皂苷皂苷浓度检测的影响，结果表明4种人参皂苷均在202 nm处的最大吸收情况和杂质影响状况均不如其在203 nm处，故本研究确定检测波长为203 nm。

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（2018-11-22收稿 责任编辑：杨觉雄）