降糖活性物6—苄氧基—9——4—氯甲苯酰基—四氢化咔唑—3—羧酸在人工胃肠液中的稳定性研究及降解产物分析

张吉泉 郝阳 陈瑞 王丽丽 汤磊

摘 要 目的：考察降糖活性物6-苄氧基-9-（-4-氯甲苯酰基）-四氢化咔唑-3-羧酸（简称“Zg02”）在人工胃肠液中的稳定性，并分析其降解产物。方法：采用高效液相色谱法，以吲哚美辛为内标，检测Zg02在空白人工胃液（pH 1.3，不含酶）、空白人工肠液（pH 6.8，不含酶）、人工胃液（pH 1.3，含胃蛋白酶）和人工肠液（pH 6.8，含胰蛋白酶）中孵育6 h的含量变化，计算Zg02剩余百分比；利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术分析对照样品（Zg02对照品溶液）、空白样品（未加入Zg02的孵育溶液）、孵育样品（稳定性试验中Zg02浓度变化最明显的孵育体系）的总离子流图，比较差异峰，通过MS图推测降解产物。结果：Zg02在空白人工肠液和人工肠液中孵育不同时间的剩余百分比均在90%～110%范围内；Zg02在酸性（pH 1.3）条件中不稳定，在孵育3 h时剩余百分比约为50%，继续孵育剩余百分比无明显变化，人工胃液（含酶）中的剩余百分比低于空白人工胃液（不含酶）的剩余百分比，但相差不明显。孵育样品与对照样品、空白样品的差异体现在负模式扫描下保留时间为5.23 min时，该时间点色谱峰的MS显示，低能量扫描通道存在m/z 320.127 2[M-H]-的准分子离子峰，高能量通道可见碎片离子峰230.081 5、276.138 2，推测Zg02在酸性（pH 1.3）条件下可能发生酰胺键断裂生成6-苄氧基-四氢化咔唑-3-羧酸。结论：Zg02在人工肠液中稳定性良好；在酸性（pH 1.3）条件下不稳定，基本上不受胃蛋白酶的影响，降解产物可能为6-苄氧基-四氢化咔唑-3-羧酸。

關键词 降糖活性物；6-苄氧基-9-（-4-氯甲苯酰基）-四氢化咔唑-3-羧酸；人工胃肠液；稳定性；降解产物

Study on the Stability of Hypoglycemic Candidate 6-benzyloxy-9-（-4-chlorobenzoyl）-tetrahydrocarbazole- 3-carboxylic Acid in Artificial Gastrointestinal Fluid and Catabolites Analysis

ZHANG Jiquan1，2，HAO Yang3，CHEN Rui2，WANG Lili2，TANG Lei2（1.College of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China；2.Guizhou Medical University/Guizhou Provincial Engineering Technology Research Center for Chemical Drug R&D， Guiyang 550004， China；3.Dept. of Pharmacy， Guiyang Maternal and Child Health-care Hospital， Guiyang 550003， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the stability of hypoglycemic candidate 6-benzyloxy-9-（-4-chlorobenzoyl）- tetrahydrocarbazole-3-carboxylic acid （abbreviated “Zg02”） in artificial gastrointestinal fluid， and to analyze its catabolites. METHODS： Using indometacin as internal standard， HPLC method was used to detect the contents of Zg02 incubated in blank artificial gastric fluid （pH 1.3，no enzyme）， blank artificial intestinal fluid （pH 6.8， no enzyme）， artificial gastric fluid （pH 1.3， containing pepsin） and artificial intestinal fluid （pH 6.8， containing trypsin） for 6 h. The remaining percentage was calculated. UPLC-Q-TOF was used to analyze TIC of control sample （Zg02 control solution）， blank sample （incubation solution without Zg02） and incubated sample （incubation system with the most obvious change of Zg02 concentration in stability test）； difference peaks were compared， and catabolites were inferred by MS map. RESULTS： The remaining percentage of Zg02 incubated in blank artificial intestinal fluid and artificial intestinal fluid for different time ranged 90%-110%. Zg02 was unstable in acidic condition （pH 1.3）. The remaining percentage was about 50% after incubated for 3 h. There was no significant change in the remaining percentage of continuous incubation. The remaining percentage of artificial gastric fluid （including enzymes） was lower than that of blank artificial gastric fluid （without enzymes）， but the difference was not obvious. The difference of incubated samples， control samples and blank samples was reflected that the retention time was 5.23 min under negative mode scanning， MS of chromatographic peaks at this time point showed that quasi-molecular ion peaks of m/z 320.127 2 [M-H]- existed in low energy scanning channels and fragment ion peaks of 230.081 5 and 276.138 2 could be seen in high energy channels. It was speculated that amide bond breakage may occur in Zg02 under acidic （pH 1.3） conditions to generate 6-benzyloxy-tetrahydrocarbazole-3-carboxylic acid. CONCLUSIONS： Zg02 is stable in artificial intestinal fluid； Zg02 is not stable in acidic condition （pH 1.3）， and is basically not affected by pepsin， the degradation products may be 6-（benzyloxy）-tetrahydrocarbazole-3-carboxylic acid.

KEYWORDS Hypoglycemic candidate； 6-benzyloxy-9-（-4-chlorobenzoyl） -tetrahydrocarbazole-3-carboxylic acid； Artificial gastrointestinal fluid； Stability； Catabolite

糖尿病是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。目前，抗糖尿病药物的研发已经成为创新药物研究的重要方向[1-2]。本课题组前期研究发现一系列四氢咔唑类化合物有明显的降糖作用，其中优选性化合物为6-苄氧基-9-（-4-氯甲苯酰基）-四氢化咔唑-3-羧酸（简称“Zg02”）[3]。Zg02具有较好的体内外降糖活性，可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）途径降低 2型糖尿病db/db小鼠的血糖和胰岛素水平[4]。Zg02是一个值得深入开发研究的候选化合物，本课题组前期已完成了对其合成工艺路线优化以克服收率低、纯化难等问题[5-6]，为接下来的成药性评价奠定了基础。

药物在胃肠道环境下的稳定性试验是药物发现和开发過程中非常必要的研究步骤，特别是口服药物在胃肠道的稳定性，将会直接影响到药物在胃肠道吸收进入血液循环的有效性[7]。所以，研究Zg02在人工胃肠液中的稳定性对评价其成药性及该类化合物的体内代谢行为具有重要意义。本研究通过高效液相色谱（HPLC）法，以吲哚美辛为内标，考察Zg02在空白人工胃肠液（未加胃蛋白酶及胰蛋白酶）及人工胃肠液中的稳定性[8]，为其吸收机制与新剂型的开发提供参考。此外还利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术，比较了空白样品、对照样品和体外孵育样品三者的图谱差异，分析Zg02可能的降解产物，指出其结构代谢不稳定位点，从而阐明Zg02可能的体内代谢行为，为其后续结构改造与优化提供理论参考。Zg02和吲哚美辛的结构式见图1。

1 材料

1.1 仪器

Xevo G2-XS型UPLC-Q-TOF/MS仪（包括MassLynx V4.1质谱工作站、UNIFI数据库）和e2695型HPLC仪（美国Waters公司）；XH-B型漩涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）；JN300-2型氮气吹扫仪（苏州吉米诺仪器有限公司）；KH-600E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；FA805N型十万分之一电子天平（上海菁海仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

Zg02原料药（贵州医科大学药物化学重点实验室制备，批号：2018052201，纯度：>98%）；吲哚美辛对照品（大连美仑生物技术有限公司，批号：J0526A5，纯度：>98%）；肝素钠（批号：325D025）、胰蛋白酶（批号：513H041，酶活性：3 000～3 500 U/g）、胃蛋白酶（批号：1104C034，酶活性：250 U/mg）均购自北京索莱宝科技有限公司；甲酸（德国CNW公司，批号：X075K150，HPLC级）；甲醇、乙腈（德国默克股份两合公司，色谱纯）；水为超纯水。

2 方法

2.1 Zg02含量测定的色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18（150 mm×4.5 mm，5 μm）；保护柱：Waters Symmetry C18（VanGuard Cartidge，3.9 mm×5 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%甲酸水（75 ∶ 25，V/V）；流速：1 mL/min；检测波长：265 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

2.2 降解产物定性检测的UPLC-Q-TOF/MS条件

色谱柱：Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.01%甲酸水（A）-0.01%甲酸乙腈（B），梯度洗脱（洗脱程序：0～2 min，95%A；2～15 min，95%→2%A；15～17 min，2%A；17～20 min，2%→95%A）；流速：0.40 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；进样时间：20 min。电喷雾电离源（ESI）；负离子模式采集（Negative mode），毛细管电压：1.5 kV；离子源温度：120 ℃，溶剂气温度：400 ℃，脱溶剂气流量：800 L/h，锥孔气流量：50 L/h；质谱数据采集及处理软件MassLynx V 4.1工作站，扫描方式MSE Continuum模式，扫描范围质荷比（m/z）：50～1 200。

2.3 溶液的制备

精密称取 Zg02原料药适量，以甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，制备成质量浓度为10 mmol/L的Zg02对照品贮备液；同样精密称取吲哚美辛对照品适量，以甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，制备成浓度为5 mmol/L的内标贮备液，4 ℃贮藏。使用时用水稀释至所需浓度。

2.4 Zg02的含量测定

2.4.1 样品处理方法 取200 μL待处理溶液，加入浓度为14.01 μmol/L的内标溶液400 μL，于4 ℃下按20 000×g高速离心10 min，取上清液进行HPLC分析，进样量为20 μL。

2.4.2 空白基质溶液的制备 取0.1 g胰蛋白酶加10 mL水于50 mL烧杯中，摇匀使其充分溶解后，加热至煮沸10 min，得到灭活的胰蛋白酶溶液。取0.1 g胃蛋白酶加10 mL水于50 mL烧杯中，摇匀使其充分溶解后，加热至煮沸10 min，得到灭活的胃蛋白酶溶液。将两液混合后，加34 mg磷酸二氢钾，溶解后加水定容至25 mL量瓶中，即为空白基质溶液。

2.4.3 专属性考察 取空白基质溶液200 μL加400 μL甲醇涡旋混匀1 min，4 ℃下以20 000×g离心10 min，取上清液20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。将一定浓度的Zg02对照品溶液和内标溶液加入至空白基质（含甲醇量1%）中，按照“2.4.1”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。

2.4.4 标准曲线绘制 取空白基质溶液198 μL，分别精密移取不同浓度的Zg02对照品溶液2 μL，制成Zg02浓度依次为1.09、2.18、4.36、10.89、21.78、43.56 μmol/L的样品溶液（含甲醇量1%），按照“2.4.1”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录峰面积。以Zg02峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标（y），Zg02的浓度为横坐标（x），进行回归分析。

2.4.5 准确度、精密度及样品稳定性考察 取空白基质198 μL，分别精密加入不同浓度的Zg02对照品溶液2 μL，制备成低、中、高浓度（2.18、10.89、21.78 μmol/L）的质控样品溶液，每一浓度平行5份，按照“2.4.1”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录峰面积，计算Zg02含量。以测得值与真实值的比值计算回收率考察准确度，以含量的RSD考察精密度。上述样品溶液处理后，室温放置12 h，再进样检测，考察稳定性。

2.5 Zg02在人工胃肠液中稳定性考察

2.5.1 人工胃液的制备 按文献[9]中方法，取16. 4 mL稀盐酸，加800 mL 水与10 g胃蛋白酶，摇匀使其充分溶解后，调节 pH至1.3，加水稀释定容至1 000 mL量瓶中，即为人工胃液。

2.5.2 人工肠液的制备 按文献[9]中方法，取6.8 g磷酸二氢钾，加500 mL水使其溶解，0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH至6.8；另称取10 g胰蛋白酶加适量水溶解，将两液混合后，加水稀释定容至 1 000 mL量瓶中，即为人工肠液。

2.5.3 稳定性试验 分别精密取50 μL浓度为的1.09 mmol/L的Zg02对照品溶液于5 mL EP管中，分成4组，分别加入空白人工胃液（未加胃蛋白酶）、空白人工肠液（未加胰蛋白酶）、人工胃液、人工肠液稀释至刻度使含醇量均为1%，分别用EP管分装200 μL，置于37 ℃水浴中孵育，分别于 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 h加入400 μL濃度为14.01 μmol/L的内标溶液，终止反应，于4 ℃下20 000×g高速离心10 min，取上清液按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录峰面积，试验平行重复3次，代入标准曲线回归方程计算相应的药物浓度。

2.6 Zg02的降解产物检测试验

采集在“2.5.3”项下稳定性试验中Zg02浓度有明显变化的孵育体系为体外孵育样品，并以Zg02对照品溶液为对照样品、未加入Zg02的孵育溶液（人工胃液、人工肠液）为空白样品，按“2.2”项下条件进行测定，比较空白样品、对照样品和体外孵育样品三者的总离子流图，找出差异峰。并根据MSE Continuum模式，得到各色谱峰的准分子离子及碎片离子信息，分析差异峰中的准分子离子峰与碎片离子峰，推测Zg02的降解产物。

3 结果

3.1 Zg02含量测定的方法学验证

3.1.1 专属性 在“2.1”项色谱条件下，Zg02和内标（吲哚美辛）能同时被检测到，保留时间分别为8.84、6.24 min，分离度良好，不受其他杂质干扰，色谱图见图2。

3.1.2 标准曲线 Zg02标准曲线回归方程为y= 0.132 8x-0.032 8（R2=0.999 3，n=6），结果表明，Zg02检测浓度的线性范围为1.09～43.56 μmol/L，定量下限为2.18 μmol/L。

3.1.3 准确度、精密度及样品稳定性 Zg02在低、中、高浓度（2.18、10.89、21.78 μmol/L）样品溶液中的准确度为（86.66±4.28）%～（94.88±6.79）%（n=5），精密度试验中含量的RSD均小于10%（n=5），稳定性试验中12 h内的RSD均小于10%（n=5），均符合相关要求，具体结果见表1。

3.2 Zg02在人工胃肠液中的稳定性

以孵育0时Zg02的理论浓度10.89 μmol/L设为剩余百分比100%，将各孵育时间点的浓度转换为剩余百分比，结果见表2。

由表2显示，Zg02在空白人工肠液和人工肠液中孵育不同时间的剩余百分比均在90%～110%范围内；Zg02在酸性（pH 1.3）条件中不稳定，在孵育3 h时剩余百分比约为50%，继续孵育剩余百分比无明显变化，推测降解反应达到平衡。

3.3 Zg02降解产物检测结果

对照样品、空白样品及体外孵育样品的总离子流图见图3。

对比图3中图谱发现，体外孵育样品与对照样品、空白样品的差异体现在负模式扫描下保留时间5.23 min时。针对5.23 min的MS图显示，低能量扫描通道存在m/z 320.127 2[M-H]-的准分子离子峰，高能量通道可见碎片离子峰230.081 5、276.138 2，降解产物的MS图见图4。

4 讨论

Zg02在人工胃肠液中稳定性的孵育时间选定在6 h内是考虑到大多数药物在胃肠的停留时间不超过6 h。

分析方法验证的目的与意义在于考察Zg02、内标与所含基质组分是否能有效分离以及在所建立的检测方法里是否准确定量。因此，需考察孵育体系中存在的缓冲液、各种酶是否能与待测样品有效分离。考虑到pH与酶是影响检测物质是否稳定的因素，所以配制空白基质时选用了已高温灭活的胃蛋白酶、胰蛋白酶。

胃肠液稳定性结果显示，Zg02在人工肠液中稳定性良好；Zg02在人工胃液（含酶）中的剩余百分比低于空白人工胃液（不含酶）的剩余百分比，但差异不明显，在系统测量误差范围内。故在描述时只能断定Zg02在酸性（pH 1.3）条件下不稳定，基本上不受胃蛋白酶的影响。

在藥物的发现与开发过程中，候选药物经常要被暴露于很多种溶液中，如有机溶剂贮备液、缓冲水溶液、生物学测定缓冲液、给药溶液以及胃肠道液体。因此，化合物在溶液中具有较好的稳定性是必要的。本研究主要考察受试化合物在胃肠道中的稳定性，了解候选化合物的代谢稳定性，为后续研究与开发提供重要参考。

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（收稿日期：2019-01-19 修回日期：2019-03-19）

（编辑：邹丽娟）