“三棱-莪术”组分配伍介导PI3K-AKT通路治疗大鼠子宫肌瘤的研究

肖红妮　刘志杰

摘要 目的：研究三棱-莪術对治疗子宫肌瘤的疗效及可能作用机制。方法：36只雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、1∶1组、1∶2组，每组9只，其中模型组、1∶1组、1∶2组制备子宫肌瘤模型，空白组、模型组用生理盐水灌胃，1∶1组、1∶2组根据三棱-莪术配伍比例进行灌胃，干预结束后比较各组子宫/卵巢系数、子宫大小，子宫病理形态以及PI3K/AKT通路标志因子的表达的变化。结果：1）模型组子宫平滑肌出现明显的病变，三棱-莪术干预后大鼠子宫组织病变有所改善，其中1∶1组改善较1∶2组明显。2）子宫肌瘤大鼠子宫系数、卵巢系数、子宫横竖径、子宫组织中E2和ER、PI3K、p-AKT/AKT表达水平均明显增加（P<0.05），经三棱-莪术干预后上述指标下降，其中术1∶1组改善较1∶2组明显（P<0.05）。结论：三棱-莪术配伍可改善子宫肌瘤，这一作用机制可能通过激活PI3K/AKT通路实现。

关键词 三棱-莪术;组分配伍;PI3K-AKT通路;大鼠;子宫肌瘤;子宫系数;卵巢系数;子宫横竖径

Study on PI3K-AKT Pathway Mediated by “Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii” Components in the Treatment of Rat Uterine Leiomyoma

Xiao Hongni，Liu Zhijie

（Department of Gynecology，People′s Liberation Army Joint Service Support Unit 94th Hospital，Lanzhou 730050，China）

Abstract Objective：To study the therapeutic effect and possible mechanism of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii in the treatment of uterine leiomyoma.Methods：A total of 36 female SD rats were randomly divided into a blank group，a model group，a 1∶1 group and a 1∶2 group，with 9 rats in each group.The model group，1∶1 group and 1∶2 group were used to prepare uterine myoma model.The blank group and the model group were given normal saline by gastric lavage.The 1∶1 group and 1∶2 group were given gastric lavage according to the compatibility ratio of trigonum and zedoary turmeric.After intervention，the changes of uterus/ovary coefficient，uterine size，uterine pathological morphology and the expression of PI3K/AKT pathway marker factors were compared in each group.Results：1）The uterine smooth muscle in the model group showed obvious pathological changes，and the uterine tissue lesions improved after the intervention of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii，and the improvement in the 1∶1 group was more obvious than that in the 1∶2 group.2）The uterine coefficient，ovarian coefficient，transverse and vertical diameter of uterus，and the expression levels of E2，ER，PI3K and p-AKT/AKT in uterine tissue of rats with uterine leiomyoma significantly increased（P<0.05）.The above indexes decreased after intervention with Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii.The improvement in 1∶1 group was more obvious than that in 1∶2 group（P<0.05）.Conclusion：The compatibility of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii can improve uterine leiomyoma，and this mechanism may be achieved by activating PI3K/AKT pathway.

Key Words Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii; Component compatibility; PI3K-AKT pathway; Rat; Uterine leiomyoma; Uterine coefficient; Ovarian coefficient; Transverse and vertical diameter of uterus

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.009

子宫肌瘤是妇科常见的良性肿瘤之一，以下腹部疼痛、坠胀不适、异常出血等为主要临床表现，严重影响妇女的孕育，更甚者常因治疗不及时而出现恶变[1]。目前子宫肌瘤的病因尚未完全明了，学者推测其可能与卵巢分泌功能紊乱、雌孕激素平衡受破坏以及生长因子异常有关[2]。随着研究的逐渐深入，越来越多文献支持肌瘤细胞增殖/凋亡失常是导致子宫肌瘤发生发展的关键，PI3K-AKT信号通路是经典的与细胞增殖/凋亡密切相关的分子信号通路，同時亦与激素受体调控环节关系密切，有研究[5]显示子宫肌瘤细胞侵袭能力的强弱与PI3K/AKT信号通路激活程度密切相关。

子宫肌瘤属于中医“癥瘕”“积聚”等范畴，《难经·五十五难》云：“气之所积为积，阳之所聚为聚，积者阴气也，聚者阳气也”。认为子宫肌瘤分为癥积与瘕聚，其中癥积乃有形之邪，并多在血分，瘕聚为无形之邪，病在气分，行气消积、破血消癥只治疗本病的关键。通过对近10年文献的整理骂我们发现气滞血瘀型是子宫肌瘤发病率最高的证型，故行气活血化瘀乃其之治则。三棱、莪术均为破血化瘀之良品，二药属于“相须”配伍的关系，首载于《经验良方》，临床亦不乏二药合用有效治疗妇科疾病的记载[6-7]。随着中医药国际化进程的推进，药物组份的配伍逐渐成为研究的热点，本团队在临床研究中证实三棱-莪术组份确可有效治疗子宫肌瘤，但二药的配伍比例及作用机制尚不明确，基于此，由此我们以子宫肌瘤模型鼠为研究对象，旨在明确三棱、莪术的配伍规律及可能作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 本研究采用36只雌性SD大鼠购买于长沙市天勤生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2014-0011，平均大鼠体质重为（200±20）g、所有的实验大鼠和饲料均经湖南省动检二站检测，均达到国家检疫标准后方签订购买合同。所有大鼠均饲养于室温（23±0.5）℃、湿度（51±3）%环境中，自由摄食，12 h/12 h交替光照。

1.1.2 药物 三棱莪术配伍组分：1）三棱总黄酮制备：取适量三棱，第一步先采用乙醇提取法进行初提，获得三棱浓缩液第二步采用石油醚对三棱浓缩液进行脱脂，随后将脱脂后的三棱样品进行聚酰胺柱层析，经过蒸馏水、乙醇的层层洗脱后进行真空干燥，获得三棱总黄酮浸膏并以此为基础配制成5 g/mL的三棱生药溶液;2）莪术挥发油的制备：第一步采用水蒸气蒸馏提取法进行初提，并以此为基础配制成2 g/mL的莪术生药溶液;3）“三棱-莪术”组分配伍：将总黄酮与挥发油按生药量进行折算，其配伍比例为1∶1，1∶2，临用前加吐温-80配成乳化剂备用。

1.1.3 试剂与仪器 大鼠雌二醇（E2）ELISA分析试剂盒（北京绿源博德生物科技有限公司，型号：F15321）;大鼠雌激素受体（ER）ELISA分析试剂盒（上海恒远生物科技有限公司，型号：XL-Er1021）;吐温-80（Solarbio life sciences公司，型号：T8360）;PI3K一抗[赛信通（上海）生物试剂有限公司，批号39202]，AKT一抗[购自赛信通（上海）生物试剂有限公司，批号2812]，p-AKT一抗[购自赛信通（上海）生物试剂有限公司，批号32412]和GAPDH一抗[赛信通（上海）生物试剂有限公司，批号16234];酶标仪[迈瑞Mindray有限公司，型号：MR-96A];电泳仪（厂家：美国伯乐BIO-RAD公司，型号：PowerPac Basic）;正置LED荧光显微镜（上海正晞仪器设备有限公司，型号：ZFM-650）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 36只雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、1∶1组、1∶2组，每组9只，其中模型组、1∶1组、1∶2组制备子宫肌瘤模型（制备方法如下）。各组大鼠在体质重、饲养环境等条件一致（P>0.05），具有可比性。子宫肌瘤模型制备：除了空白组外，其余的SD雌性大鼠每日灌胃给予己烯雌酚药液1.35 mg/kg、下肢外侧肌肉注射黄体酮注射液1.0 mg/只，3次/周，间隔1 d注射，连续5周;最后2周（即第4周和第5周）开始皮下注射盐酸肾上腺素注射液0.9 mg/（kg·d），注射4 h后给予随机给予1种慢性不可预见性刺激，保证整个周期中每种刺激不少于2次。慢性不可预见性刺激分别为以下5种：1）连续3 h不间断的60 db噪声刺激，2）昼夜颠倒，3）5～10 ℃冰水浴游泳4 min，4）悬尾10 min，5）50 ℃烘箱烘10 min）。空白组每日灌胃2 mL生理盐水，下肢外侧肌肉注射生理盐水0.05 mL/只，3次/周，间隔1 d注射，连续5周。

1.2.2 干预方法 1）空白组：10 mL（kg·只）生理盐水灌胃;2）模型组：10 mL/（kg·只）生理盐水灌胃;3）三棱莪术1∶1组：根据1∶1配伍比例10 mL（kg·只）灌胃给药;4）三棱莪术1∶2组：根据1∶2配伍比例10 mL/kg/只灌胃给药。均连续给药10周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 子宫和卵巢系数 大鼠常规麻醉处死后，解剖取出所需子宫组织和卵巢组织，清除组织表面脂肪和血迹，称取各脏器湿重，计算子宫和卵巢系数，子宫系数=子宫湿重/大鼠体质重×100;卵巢系数=卵巢湿重/大鼠体质重×100%。

1.2.3.2 子宫横径和竖径 采用游标卡尺测量子宫分角上的部分，记录子宫横径和子宫竖径，其中子宫横径为子宫两分支中最宽处的长度;子宫竖径为子宫两分支中较长一支的长度。

1.2.3.3 子宫病理学观察 取子宫分角上病理改变较典型部位的组织，常规固定石蜡包埋制作病理切片，经过常规HE染色后，在正置LED荧光显微镜下观察子宫平滑肌细胞的细胞排列、体积及数量等形态，观察是否有炎性浸润等。

1.2.3.4 酶联免疫吸附试验（ELISA） 检测E2和ER子宫均浆组织，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行检测E2、ER，包被、封闭酶标反应孔、洗涤、加入待检测样品、加入酶标抗体、加入底物液、终止反应等过程均严格按照说明书进行，检测时一定要首先进行标准品的复孔设置，使标准曲线的可靠性加强。

1.2.3.5 Western blot检测PI3K/AKT信号通路 裂解液各组大鼠子宫组织，取上清;采用BCA法测蛋白浓度;将等量蛋白（50 μg）上样至SDS-PAGE凝胶电泳2 h;PVDF膜转膜，条件：100 V，100 mA，2 h;5%脱脂奶粉封闭2 h;PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH一抗抗体孵育，4 ℃過夜后;加入HRP标记二抗;用化学发光法系统对蛋白条带进行显影及拍照分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验;计数资料用例（%）表示，进行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 “三棱-莪术”组方对子宫病理形态的影响 空白组的子宫组织形态学显示子宫平滑肌细胞排列、体积及数量均正常，排列有序未见明显病变;模型组显示子宫平滑肌纤维排列紊乱无序，体积变大，黏膜上皮细胞出现增生变厚，肌层和肌间均可见炎性细胞浸润;三棱莪术1∶1组细胞排列较模型组有序，黏膜上皮细胞仅有少量空泡变性;三棱莪术1∶2组可见肌纤维排列紊乱但较模型组有序，黏膜上皮细胞空泡变性较三棱莪术1∶1组多，肌层少量炎性细胞浸润较模型组轻微。见图1。

2.2 “三棱-莪术”组分对子宫/卵巢系数、子宫横竖径的影响 与空白组比较，模型组、三棱莪术1∶1组、三棱莪术1∶2组的子宫系数、卵巢系数、子宫横径和竖径均明显增加（P<0.05）;三棱莪术1∶1组、三棱莪术1∶2组较模型组均明显下降（P<0.05），其中三棱莪术1∶1组下降程度优于三棱莪术1∶2组（P<0.05）。见表1。

2.3 三棱-莪术”组分对子宫组织中E2和ER表达水平影响 与空白组比较，模型组、三棱莪术1∶1组、三棱莪术1∶2组的子宫组织中E2和ER表达水平均明显上调（P<0.05）;三棱莪术1∶1组、三棱莪术1∶2组较模型组均明显下调（P<;0.05），其中三棱莪术1∶1组下调程度优于三棱莪术1∶2组（P<0.05）。见表2。

2.4 三棱-莪术”组分对对PI3K/AKT通路的影响 与空白组比较，模型组、三棱莪术1∶1组、三棱莪术1∶2组的子宫组织中PI3K/GAPDH、p-AKT/AKT表达水平均明显上调（P<0.05）;三棱莪术1∶1组、三棱莪术1∶2组较模型组均明显下调（P<0.05），其中三棱莪术1∶1组下调程度优于三棱莪术1∶2组（P<0.05）。见表3及图2。

3 讨论

3.1 三棱-莪术组分配伍的用药比例 莪术，性味属辛苦温，归属于肝脾两经。该药首载于《药性论》，有破气行血、消积止痛的作用。常用于气滞血瘀所致的癥瘕积聚、经闭痛经、心腹瘀痛、食积脘腹胀痛等。早在明代《药品化义》亦云：“蓬术味辛性烈，专攻气中之血，主破积消坚，去积聚癖块，经闭血瘀，扑损疼痛，与三棱功用颇同”，书中蓬术即莪术，莪术油是发挥药效的主要成分，现代医学认为莪术油是莪术发挥抗肿瘤药效物质基础，该成分同时还可预防血栓、消炎、抑制肝纤维化以及镇痛等[8-10]。三棱，性味属辛苦平温，亦归属于肝脾两经，乃止血、消食和胃、破血行气之要药。虽然莪术与三棱均有破气行血之功，但《医学衷中参西录》中记载：“三棱、莪术二药性皆微温，为化瘀血之要药。若细核二药之区别，化血之力三棱优于莪术，理气之力莪术优于三棱”，故目前认为三棱偏于破血，莪术偏于破气，二药因“相须”为用。三棱总黄酮是三棱的主要药物成分，大量的基础实验[11-14]证实三棱总黄酮具有理想的抗栓作用，同时亦有抗肿瘤、消炎镇痛效应。在诸多古籍中三棱-莪术应用比例多为1∶1，正如《医学衷中参西录》中的理冲汤方中三棱-莪术各9 g，旨在调经祛瘀，主治主治妇女经闭不行、阳虚作冷、食少劳嗽等。《普济方》中的三棱莪术汤亦将三棱-莪术等分为用，以治疗小儿疳积。现代临床报道亦不乏三棱-莪术1∶1应用治疗子宫肌瘤的报道，如贾文芳[15]用海藻昆布汤（三棱和莪术各10 g）治疗子宫肌瘤，其有效率高达82.35%;辛昕[16]亦使用等份的三棱-莪术对子宫肌瘤患者进行中药穴位贴敷，结果显示83.33%比例的患者治疗有效。由此可见三棱-莪术1∶1比例具有扎实的临床研究支持。在本研究中我们将SD雌性大鼠随机分为4组，模拟子宫肌瘤病理，将三棱-莪术比例设置为1∶1及1∶2 2组，结果显示三棱-莪术1∶1组在降低子宫、卵巢系数方面明显优于1∶2组，同时，与1∶2组比较，1∶1组大鼠的子宫组织的纤维化程度受到更为明显的抑制。佐证了三棱-莪术1∶1比例对子宫肌瘤确有更为理想的疗效。

3.2 基于PI3K-AKT信号通路探讨三棱-莪术组分抗子宫肌瘤的作用机制 近年来大量研究对三棱-莪术组分的作用机制进行研究，但目前尚无明确结论。目前资料显示当孕激素表达减少或雌激素作用被抑制时，孕激素诱发子宫肌瘤增殖的效应被拮抗，故我们认为雌激素与孕激素在研究子宫肌瘤发生发展方面均具有重要作用。子宫内膜细胞异常增殖的同时E2和ER被活化，进一步介导激素相关的细胞应该传递通路的活性，从而导致子宫内膜细胞产生异常的有丝分裂，从而影响了肌瘤细胞的增殖、分化、增生等过程。在本研究中我们发现E2和ER在模型鼠中存在高表达，随着三棱-莪术组分的干预，大鼠的E2和ER水平逐渐减少，我们有理由相信三棱-莪术组分抗子宫肌瘤的可能机制与纠正孕激素和雌激素异常激活有关，其中1∶1比例组显示出了更明显的优势。ER水平的高低受到多方因素的调控，大量的分子信号通路均可通过转录、翻译、剪切等途径对ER的表达进行介导，其中PI3K/Akt信号通路是目前备受关注的机制之一。生长因子将PI3K活化后将下游的磷脂酰肌醇催化成二磷酸磷酯酰肌醇、三磷酸磷酯酰肌醇，上述2种物质均是细胞重要的第二信使，二磷酸磷酯酰肌醇及三磷酸磷酯酰肌醇被催化激活后进一步将下游的AKT活化，AKT的功能涉及细胞周期调控、凋亡的启动、血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭性等诸多方面[17-18]，与诸多疾病均有密切关系。本研究结果显示，与空白组比较模型组及三棱-莪术组分组大鼠子宫组织的PI3K、p-AKT浓度上调，其中三棱-莪术组PI3K、p-AKT浓度较模型组明显降低，其中1∶1比例组大鼠降低更为明显，这提示1∶1三棱-莪术组分可更有效治疗子宫肌瘤，且其作用机制可能是通过介导PI3K/Akt通路实现。

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（2019-07-15收稿 责任编辑：王明）