DNA修复基因的拷贝数变异与年龄相关性白内障的关系△

姜瑾 朱蓉嵘 胡楠 周婧 杨梅 管怀进

白内障是世界范围内患者视力损害和致盲的最主要原因[1]。年龄相关性白内障(age-related cataract，ARC)是最为常见的白内障类型，其发病率随年龄升高而增加。因为全球人口老龄化，ARC引起的致盲给全世界带来越来越沉重的负担[2]。ARC的确切病因和发病机制尚未十分清楚。氧化损伤被视为晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LEC)凋亡的重要调控因素，且在ARC发病机制中起至关重要的作用[3-4]。最近的研究报道LEC中活性氧所致DNA损伤与ARC发病有关[5-7]。DNA氧化损伤的修复机制包括直接修复、错配修复、碱基切除修复(base excision repair，BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)以及双链断裂修复(double strand break repair，DSBR)[8-9]。根据功能划分，ERCC6、WRN以及OGG1基因分别作用于NER、DSB以及BER途径[10]。最近的报道指出HSF4也作用于DSB途径[11]。有研究证实DNA修复基因的多态性与年龄相关性黄斑变性(age-related degeneration，AMD)以及ARC的易感性有关[9-10]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)和拷贝数变异(copy number variations，CNV)是两种主要的遗传变异类型。CNV与染色体重组以及一些遗传疾病的发生有密切关系，并且对人类抗病性和易感性等表型变异的影响至关重要[12]。目前，CNV已成为基因多态性研究的热点，本课题组前期研究证实GSTT1基因的CNV与汉族人群对ARC的易感性有关[13]。

本研究从江苏眼病研究中选择ARC组和对照组，使用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测江苏省汉族人群中四种DNA修复基因的CNV，探讨DNA修复基因的CNV与ARC易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料临床资料来源于江苏眼病研究流行病学调查基地[2]，现场工作于2010年10月至2011年5月进行。分为对照组525人和ARC组780例。ARC组入选标准：(1)晶状体混浊；(2)年龄≥50岁；(3)最佳矫正视力<20/40[14]；(4)没有其他明确的导致白内障的原因。排除标准：(1)青光眼、高度近视、葡萄膜炎、糖尿病、眼外伤以及其他原因引起的白内障；(2)任何一眼为无晶状体眼或者人工晶状体眼；(3)以前接受过放射治疗或者激素治疗的患者。根据标准，筛选出ARC患者，并根据LOCSⅢ分级系统对晶状体混浊程度进行分级[14-15]。ARC组包含皮质性257例，核性368例，后囊下性34例以及混合性121例。

对照组与ARC组无亲属关系，均无ARC家族史。入选标准：(1)晶状体透明；(2)最佳矫正视力均≥20/25。排除标准：(1)伴其他眼病：晶状体脱位、青光眼、近视、黄斑病变、糖尿病视网膜病变以及葡萄膜炎；(2)伴其他系统性疾病：糖尿病、肾病以及癌症等。ARC组与对照组年龄、性别比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。本研究遵守赫尔辛基宣言，并通过南通大学附属医院伦理委员会批准，每一位受试者纳入前均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取用一次性真空采血管采集受试者外周静脉血2 mL，20 g·L-1EDTA抗凝，混匀，-70 ℃恒温冻存备用。采用酚-氯仿-异戊醇法提取外周血白细胞基因组的DNA，并通过Gene Quant 100紫外分光光度计测量DNA的浓度和纯度。

1.2.2 基因CN的检测运用美国ABI公司的双重RT-PCR CN分析方法检测目的基因的CN。购买DNA修复基因的TaqMan CN探针，即FAM标记探针，见表1。购买以VIC标记的内参基因探针，本研究中选择RNaseP为CNV内参基因(目前认定在人类的各种细胞中，该基因都为两个拷贝)。

表1 TaqMan CN探针信息

项目基因ERCC6WRNOGG1HSF4目标变异号Variation_60013-Variation_115655Variation_114213探针序列号Hs01920803_cnHs06237156_cnHs01955678_cnHs02989737_cn染色体位置Chr10:50681070Chr8:30954001Chr3:9803327Chr.16:6719837染色体区段10q11.23a8p12d3p25.3c16q22.1a探针基因位置内含子14-外显子15内含子 16内含子6-外显子6内含子2-外显子3

将所有样本的DNA浓度稀释至0.01 g·L-1。RT-PCR总反应体系为10.0 μL，包含2×Taq Man PCR 反应液5.0 μL，DNA模板2.0 μL，TaqMan CN探针0.5 μL，TaqMan CN内参探针0.5 μL以及去离子水2.0 μL。

RT-PCR反应条件：95 ℃预变性10 min后进入反应循环：95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个样本进行目的基因扩增时均重复3次。通过检测PCR过程中PCR产物与相应探针结合之后产生的荧光信号，比较目的基因和内参基因的Ct值(threshold value)，以已知CN的人类基因组DNA为标准品，在CopyCaller 2.0软件中用△△Ct值的方法计算初始反应模板的相对含量，分析目的基因的CN。

1.3 统计学分析运用Stata 10.0软件包建立数据库并进行统计学分析。采用独立样本t检验和卡方检验比较ARC组和对照组间年龄和性别的差异。采用卡方检验比较ARC组和对照组每个基因的CN类别(CN=0、1、2或者3+)的差异，其中CN=2的组为参考值组。Logistic回归分析计算ARC组和对照组的相对危险度(odds ratio，OR)及95%可信区间(confidence interval，CI)。检验水准：α=0.05。如果最初的分析显示差异有统计学意义，进一步将P值进行多重校正，得出校正P(Pc)值。

2 结果

2.1 ARC组与对照组四种基因的CNV分析结果ARC组和对照组的WRN基因中，均发现了新的CNV。WRN基因高拷贝(CN=3+)与ARC的易感性有关(P=0.02)。HSF4基因低拷贝(CN=1)的人群对ARC易感(P=0.004)。然而，经过多重校正后，WRN基因高拷贝对ARC的易感性无统计学意义(Pc>0.05)，见表2。

2.2 四种基因的CNV与各亚型ARC易感性的关系WRN基因高拷贝与核性以及后囊下性ARC的易感性有关(均为P=0.02)。然而，经过多重校正后发现，这种易感性并无统计学意义(Pc>0.05)。HSF4基因低拷贝与核性以及后囊下性ARC的易感性有关(Pc=0.004、Pc=0.04)，见表3。

表2 ARC组与对照组四种基因的CNV

CNARC组[n(%)]对照组[n(%)]OR(95%CI)P/Pc值ERCC6 00(0)0(0)-- 17(0.9)7(1.3)0.68(0.24～1.96)0.48 2742(95.1)506(96.4)1.0(参考值)- 3+31(4.0)12(2.3)1.76(0.90～3.46)0.10WRN 01(0.1)1(0.2)0.69(0.04～11.08)0.79 14(0.5)4(0.8)0.69(0.17～2.78)0.60 2726(93.1)502(95.6)1.0(参考值)- 3+49(6.3)18(3.4)1.88(1.08～3.27)0.02/0.08OGG1 00(0)0(0)-- 110(1.3)5(1.0)1.35(0.46～3.98)0.58 2760(97.4)514(97.9)1.0(参考值)- 3+10(1.3)6(1.1)1.13(0.41～3.12)0.82HSF4 00(0)0(0)-- 129(3.7)5(1.0)4.09(1.57～10.63)0.004/0.016 2724(92.8)510(97.1)1.0(参考值)- 3+27(3.5)10(1.9)1.90(0.91～3.96)0.09

2.3 不同性别分组后四种基因的CNV与ARC易感性的关系WRN基因高拷贝与女性对ARC的易感性有关(P=0.03)。HSF4基因低拷贝与女性对ARC的易感性有关(P=0.01)。经过多重校正后，仅HSF4基因低拷贝与女性对ARC的易感性有关(Pc=0.04)。WRN和HSF4基因的联合作用与不同性别组对ARC易感性的关系，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表3 ARC组与对照组CNV与各亚型ARC易感性的关系

CN对照组[n(%)]ARC组[n(%)]皮质性(n=257)核性(n=368)后囊下性(n=34)混合性(n=121)ERCC6 00(0)0(0)0(0)0(0)0(0) 17(1.3)2(0.8)5(1.4)0(0)0(0) 2506(96.4)245(95.3)350(95.1)33(97.1)114(94.2) 3+12(2.3)10(3.9)13(3.5)1(2.9)7(5.8)WRN 01(0.2)0(0)1(0.3)0(0)0(0) 14(0.8)1(0.4)3(0.8)0(0)0(0) 2502(95.6)244(95.0)339(92.1)30(88.2)113(93.4) 3+18(3.4)12(4.7)25(6.8)∗4(11.8)∗8(6.6)OGG1 00(0)0(0)0(0)0(0)0(0) 15(1.0)2(0.8)5(1.4)1(2.9)2(1.7) 2514(97.9)251(97.7)358(97.3)32(94.1)119(98.3) 3+6(1.1)4(1.6)5(1.4)1(2.9)0(0)HSF4 00(0)0(0)0(0)0(0)0(0) 15(1.0)6(2.3)19(5.2)∗∗2(5.9)∗∗2(1.7) 2510(97.1)240(93.4)338(91.8)30(88.2)116(95.9) 3+10(1.9)11(4.3)11(3.0)2(5.9)3(2.5)

注：*P<0.05，Pc>0.05；**P<0.05，Pc<0.05，均为相应ARC组与对照组相比较

表4 不同性别ARC组和对照组的CNV与ARC易感性的关系

CN男性ARC组[n(%)]对照组[n(%)]OR(95%CI)P/Pc值女性ARC组[n(%)]对照组[n(%)]OR(95%CI)P/Pc值WRN 00(0)1(0.4)0.26(0.01～6.37)0.261(0.2)0(0)1.91(0.08～47.14)0.43 12(0.6)3(1.3)0.52(0.09～3.12)0.462(0.4)1(0.3)1.27(0.11～14.12)0.84 2288(92.9)223(94.1)1.0(参考值)-438(93.2)279(96.9)1.0(参考值)- 3+20(6.5)10(4.2)1.55(0.71～3.38)0.2729(6.2)8(2.8)2.31(1.04～5.12)0.03/0.12HSF4 00(0)0(0)--0(0)0(0)-- 19(2.9)2(0.8)3.54(0.76～16.56)0.0920(4.3)3(1.0)4.33(1.27～14.70)0.01/0.04 2291(93.9)229(96.6)1.0(参考值)-433(92.1)281(97.6)1.0(参考值)- 3+10(3.2)6(2.5)1.31(0.47～3.66)0.6017(3.6)4(1.4)2.76(0.92～8.28)0.06

2.4 四种基因的CNV与ARC易感性的关系HSF4基因的CNV联合作用与ARC的易感性有关(P=0.001)。WRN和HSF4基因的CNV联合作用显著增加了ARC的易感性，OR值从单纯HSF4基因的2.63上升到联合作用后的6.80。其他基因CNV的联合作用与ARC的易感性均无关(均为P>0.05)，见表5。

表5 四种基因的CNV联合作用与ARC易感性的关系

基因CN高拷贝或低拷贝ARC组[n(%)]对照组[n(%)]OR(95%CI)P/Pc值ERCC638(4.87)19(3.62)1.36(0.78～2.39)0.28WRN54(6.92)23(4.38)1.62(0.98～2.68)0.06OGG120(2.56)11(2.10)1.23(0.58～2.59)0.59HSF456(7.18)15(2.86)2.63(1.47～4.70)0.001/0.004ERCC6+WRN10(1.28)7(1.33)0.96(0.36～2.54)0.94ERCC6+OGG12(0.26)5(0.95)0.27(0.05～1.38)0.09ERCC6+HSF43(0.38)3(0.57)0.67(0.14～3.34)0.60WRN+OGG14(0.51)2(0.38)1.35(0.25～7.39)0.73WRN+HSF410(1.28)1(0.19)6.80(0.87～53.35)0.03/0.12OGG1+HSF45(0.64)3(0.57)1.12(0.27～4.72)0.87

3 讨论

ARC的确切病因及发生机制尚不完全清楚。随着基因测序的完成，SNPs以及CNV对ARC的影响已成为国内外研究的热点。本研究以“江苏眼病研究”流行病学人群为研究对象，来探讨DNA修复基因的CNV与ARC易感性的关系。由于特殊的地理背景和生活习惯，研究对象具有遗传学上相对均质的特点，克服了病例对照研究所存在的选择偏倚，具有良好的可信性和代表性。本研究所得的基因多态性结果同时也反映其在中国汉族人群中的分布。

大多数CNV是稳定的，并且可以遗传。CNV引起的基因重组可能通过基因剂量效应打断基因，创造融合基因，施加位置影响，或者暴露一个有害的隐性突变来编码致病性表型[16-18]。所以，CN增加不一定导致基因功能的增强，也可能会导致基因功能丧失。

DNA修复途径的缺陷可能导致许多不同类型的疾病产生。WRN基因在DNA的损伤修复过程中起到重要的作用[19]。迄今为止，科学家们证实了WRN基因的SNPs与许多年龄相关性疾病有关，如心血管疾病以及某些癌症[20-22]。在人类基因组变异数据库上未见报道WRN基因存在CNV，但本研究发现了WRN基因的CNV。这个CNV仍需通过其他检测方法，以及在其他人群中进行验证。本研究还发现WRN基因高拷贝的人群容易患ARC。目前人晶状体蛋白质中WRN基因的正常表达尚未完全清楚[23]。因此，WRN基因CNV的功能性序列以及它对晶状体蛋白质表达的影响仍需要进一步研究。

最近的研究证实HSF4基因与DNA的DSB途径有关[11]。除此之外，HSF4基因编码一系列的晶状体结构蛋白，HSF4基因的突变导致这些蛋白的表达降低[24-25]。有报道显示HSF4基因与部分汉族人对ARC的易感性有关[26]。本研究发现HSF4基因低拷贝是ARC的易感因素。并且这种易感性在核性以及后囊下性ARC尤为明显。DNA修复功能受损以及晶状体结构蛋白的低表达可能与这种易感性有关。

CNV与核性以及后囊下性ARC的易感性密切相关可能是因为氧化损伤以及遗传因素对不同种类的ARC所起的作用不同。有证据显示氧化损伤对核性ARC的作用大于皮质性以及后囊下性。此外，家族史被认为是ARC的高危因素[27-28]，Hammond等[29]对双胞胎的研究证实了核性ARC 48%与遗传有关。本研究的研究对象来自江苏眼病研究基地，总样本量在流行病学调查阶段就已经确定了。在总样本中，ARC组的构成比较小，因此本研究中ARC组样本量较少。这导致了不可避免的抽样误差。后续的流行病学调查工作中，本课题组将进一步验证ARC组的试验结果。

全世界范围内都有报道女性的ARC患病率更高[30-31]。Vashist等[30]报道女性对ARC的易感性可能来源于一些内在差异，如激素水平的不同。雌激素可能有预防ARC发生的作用。本研究提示HSF4基因单拷贝的女性更容易患ARC。雌激素水平的下降以及DNA修复能力的损伤可能协同作用，最终导致ARC的发生。

有研究报道ERCC6基因的SNPs与ARC以及AMD的易感性有关[32-33]。Zhang等[10]报道OGG1-Ser326Cys多态性与ARC的易感性有关。但是，本研究没有发现ERCC6以及OGG1的CNV与ARC的发病风险有关。这可能是因为ERCC6和OGG1的异常拷贝(CN≠2)个体相对而言比较罕见。

本研究发现，WRN与HSF4基因CNV的联合作用可以提高罹患ARC的风险。ARC是一种复杂性疾病，它的发生可能不仅与一种CNV有关，多种CNV的联合作用以及多种基因变异形式的联合作用可能与ARC的发病风险有关[16]。

本研究发现，汉族人群中DNA修复基因的CNV与ARC的易感性有关。在将来的研究中，本课题组将进一步探讨这些CNV的功能序列以及它们影响表达的潜在机制，以期为ARC的针对性预防、诊断和基因治疗提供理论依据。