烟草过氧化氢酶基因CAT2克隆与表达特征分析

侯含 王升平 张超群 等

摘  要：基于已有的植物Catalase 2基因（CAT2）序列设计烟草Nicotiana tabacum CAT2的特异性引物，通过RT-PCR扩增克隆获得Nicotiana tabacum var. NC89 CAT2 全长mRNA序列，包含1479 bp完整的读码框（ORF），可编码492个氨基酸残基。遗传进化分析显示，烟草NC89 CAT2与N. benthamiana CAT2基因亲缘关系最近。利用Quantitative Real-time PCR技术分析了CAT2基因在NC89烟草中的组织特异性表达和其应对生物和非生物胁迫的表达差异。结果表明，CAT2基因在烟草NC89的根、茎、叶、花瓣、花萼、种子中均有表达，其中在花中相对表达量最高，其次为叶、茎、种子和根。生物和非生物胁迫处理烟株，其CAT2诱导表达分析显示，机械损伤、渗透压、低温和高温、干旱和感染PVY时CAT2表达量均上调。上述研究表明烟草CAT2基因可能参与了应对非生物和生物胁迫的过程。

关键词：烟草;Catalase 2;非生物胁迫;生物胁迫

中图分类号：S572.03          文章编号：1007-5119（2019）01-0001-08      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.001

Abstract： The full-length cDNA of Catalase 2 （CAT2） from Nicotiana tabacum var. NC89 was cloned usingspecific primers designed according to CAT2 mRNA sequences in other plants. Amino acid sequence alignment indicated that CAT2 contains a complete reading frame （ORF） of 1479 bp， which encodes 492 amino acid residues. Phylogenetic analysis showed that NC89 CAT2 shares high similarity with the CAT2 gene from N. benthamiana. Quantitative real-time PCR （qPCR） analysis revealed that CAT2 is highly expressed in petal and calyx， while less expressed in leaves， stems， seeds， and roots. The expression of NC89 CAT2 was enhanced by abiotic and biotic stressors， such as mechanical damage， osmotic pressure， low temperature， high temperature， drought and PVY infection. It was suggested that CAT2 plays an important role in growth， development， and interplay of abiotic and biotic stresses in plant.

Keywords： Nicotiana tabacum; Catalase2; abiotic stress; biotic stress

过氧化氢酶（Catalase，CAT）又称触酶，是第一个被发现的抗氧化酶，LOEW[1]将其命名为Catalase，其广泛存在于能呼吸的生物体内，在植物体内主要存在于叶绿体、线粒体、内质网中，而在动物体内主要存在于肝和红细胞中。

CATs与SOD、POD、ASP一起被称为酶保护

基金项目：江西省烟草公司科技项目“江西烟草病毒病绿色防控技术研究与应用”（201701002）;四川省烟草公司科技项目“烟草病毒病快速检测技术的开发与应用”（SCYC201804）;广西壮族自治区烟草公司科技项目“广西烟草绿色防控重大专项技术研究与推广应用”（201745000024095）;湖南省烟草公司科技项目“湖南烟区主要病毒病防控关键技术研究”（201743010020088）

作者简介：侯  含（1991-），女，研究生，研究方向：分子植物病理学。E-mail：angelichh@163.com。*通信作者，E-mail：yangjinguang@caas.cn

收稿日期：2018-07-17                  修回日期：2018-10-19

系統[2]，其主要功能是将过氧化氢分解为水和氧气，从而清除植物光呼吸、脂肪酸β氧化和线粒体电子传递等过程中产生的H2O2，在植物防御、胁迫应答、控制细胞的氧化还原平衡和延缓衰老等方面起着重要作用[3]。前人已有研究，增强植物体内抗氧化酶活性和抗氧化代谢水平可以提高植物本身的抗逆性[4-5]。在植物体内，CATs家族由多基因编码，其表达随时空的不同而变化，也受到干旱、重金属、高盐、温度、光照等非生物因子和病原等生物因子的双重影响[6]。

本研究基于已经报道的CAT2基因的序列，对烟草NC89（Nicotiana tabacum var. NC89）CAT2基因进行了克隆和表达分析，揭示了烟草CAT2基因在植物应对生物胁迫和非生物胁迫中的功能，为深入研究植物的抗病和抗逆机制提供重要理论依据;同时利用基因工程技术，为提高植物对各种胁迫的适应能力和改善生态环境提供新的思路。

1  材料与方法

1.1  供试材料

烟草材料及毒源：NC89、马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）毒源为中国农业科学院烟草研究所保存。除特别注明，烟草材料在25 ℃，14 h光照/10 h黑暗条件下培养。

1.2  研究地点与方法

1.2.1  试验地点  中国农业科学院烟草研究所气候室。

1.2.2  培养方法  药品材料：LB固体和液体培养基;RNA提取试剂盒，cDNA反转录试剂盒，pEASY-T1载体，大肠杆菌DH5α购于青岛群昌科贸有限公司（TRANS）;dNTP Mixture，Taq酶，Loading buffer，DNA marker、DNA凝胶回收试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）;氨苄青霉素钠盐购自上海生工生物工程技术服务有限公司。引物合成由宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）完成。

1.2.3  总RNA提取、反转录  将烟草组织采集后

放入液氮中速冻并转入−80 ℃超低温冰箱保存。不同组织总RNA提取及反转录cDNA参照试剂盒说明书，引物为通用引物OligdT18。

1.2.4  克隆、鉴定及测序  PCR扩增体系：cDNA 1 μL、引物各2 μL、10×Trans Taq HiFi Buffer Ⅱ 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、Trans Taq TMHiFi DNA Polymerase 1 μL、ddH2O 35 μL，总体积为50 μL。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳后，按凝胶回收试剂盒的说明，回收得到的目的DNA片段，并连接到载体pEASY-T1上，转化至大肠杆菌DH5α上，对获得的阳性克隆进行测序（由上海英潍捷基贸易有限公司测定）。

1.2.5  样品预处理  不同组织：分别取正常生长条件下成熟烟草NC89的根、茎、叶、花瓣、花萼和种子。

机械损伤：对NC89从上往下第2片叶进行针刺伤害处理，每片叶针刺50次，4、8、12、16 h 后分别取材，以正常生长为对照。

渗透压：采用250 mmol/L NaCl喷施叶面处理2、4、6、8、10 h，取上部第2片叶，以清水处理为对照。

温度处理：以25 ℃处理为对照，在4 ℃和40 ℃环境下培养NC89幼苗，分别于4、8、12、16 h取上部第2片叶，以相同温度的清水浇灌。

干旱处理：于消除浇水1、3、5、7 d采集上部第2片叶，以正常浇水为对照。

紫外处理：紫外照射2、4、6、8、10 h，采集上部第2片叶片，以正常条件下叶片作对照。

接毒处理：NC89接种PVY病毒24、48和72 h后取上部第2片叶，以清水处理为对照。

每个处理3次生物重复，处理后取样研磨分装保存，置于−80 ℃条件下保存备用。

1.2.6  Quantitative real-time PCR对表达差异的分析  提取各处理样品总RNA并反转录成cDNA，根据克隆获得的烟草CAT基因序列，通过Primer软件进行Quantitative real-time PCR特异性引物设计[7]，然后利用Oligo 6.0软件和在线数据库Oligo

Calc（http：//www.basic.northwestern.edu/biotools/ oligocalc.html）对所设计的引物进行评价，并通过在线BLSAT程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）进行验证，以避免引物序列与烟草基因组其他序列同源。引物为CAT2-F、CAT2-R、18sF、18sR，其中18s rRNA为内参基因（表1）。Quantitative real-time PCR反应在AB7500（Applied Biosystems 7500 Real-time）PCR仪进行，反应体系的配制均按TaKaRa SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行。测定值用平均值加标准差表示，采用CT值来比较各基因的相对表达量，目的基因相对表达量用目的基因mRNA表达水平比内参基因mRNA表达水平的相对倍数来表示，分析CAT2基因在不同组织、非生物和生物胁迫下表达差异。

2  结  果

2.1  基因克隆及序列分析

根据GenBank中已有的植物CAT2基因序列设计一对烟草CAT2的特异性引物（CAT2F、CAT2R），通过烟草叶片的总RNA提取，PCR扩增和测序，获取片段为1489 bp（图1），其序列如下：

通过NCBI的ORF finder软件对CAT2全长cDNA序列进行分析，其中包含1479 bp完整的读

码框（ORF），可编码492个氨基酸残基。经过ExPASy网站ProtParam在线工具分析（http：//www. expasy. org/proteomics）预测NC89 CAT2分子量为56.41 kDa，等電点（pI）为6.87。

利用MEGA 4.0软件通过Neighbor-Joining（N-J邻接法）对已确定不同物种的CAT序列与NC89的CAT2序列进行比对构建系统进化树（图2）。在选取的13个物种中，明显分为3大类。水稻、小麦、玉米和大豆分为一簇;普通烟草、辣椒、番茄和拟南芥分为一簇;NC89、白花单叶烟草、茄子、龙葵和马铃薯分为另一大簇，而在这一簇中茄子单独一组，马铃薯和龙葵一组，而NC89和白花单叶烟草一组亲缘性关系较近。

2.2  不同器官表达特异性分析

烟草NC89不同组织CAT2基因表达量分析显示（图3），CAT2基因在烟草NC89的根、茎、叶、

花瓣、花萼、种子中均有表达，但是不同组织间存在较大的差异。CAT2基因在根组织表达量最低，花萼组织中表达量最高，约是根组织的585 000倍，其次是花瓣，约是根组织的74 990倍，而叶组织中表达量约是根组织的7250倍，茎和种子组织表达量也很低与根组织表达量相近。

2.3  CAT2胁迫表达分析

为检测CAT2基因在植物抗逆过程中的作用，对NC89烟苗在生物胁迫和非生物胁迫条件下基因表达水平进行了qPCR分析（图4），可知机械损伤4 h后，CAT2基因表达量较对照已有增长;处理8、12 h后CAT2基因表达量升高，分别为对照的11倍、15倍;在机械损伤处理16 h后表达量是对照的45倍。

NaCl处理2 h后CAT2基因的表达量与对照相近;处理4 h后CAT2的表达量增长至对照的2倍;处理6 h后CAT2表达量为对照的60倍。处理8 h、10 h后CAT2基因的相对表达量明显下降，与对照基本持平。

在低温（4 ℃）胁迫4 h时CAT2基因的相对表达量达到较高值为对照的8倍;处理8 h后CAT2的表达量降低为对照的3倍;在处理后12 h、16 h出现其表达量明显下降，并在16 h后达到最低值。

高温（40 ℃）胁迫4 h后，CAT2基因相对表达量与对照基本相同;CAT2在高温处理8 h后表达量为对照的2750倍;CAT2在处理12 h和16 h后基因相对表达量分别降低为对照的240倍、1550倍。

干旱处理1 d后CAT2基因表达量达到高峰，为对照的7倍;处理3 d后表达量降低至与对照持平，而处理5 d、7 d后CAT2的表达量与对照一致。

紫外处理2 h、4 h时CAT2基因表达量低于对照;处理6 h后，CAT2表达量开始增长与对照持平;处理8 h后CAT2基因表达量出现明显增长，达到对照的5000倍;处理10 h后CAT2达到高峰为对照的6000倍。

接种PVY 24 h后（图5）CAT2基因相对表达量增长至对照的44倍;处理48 h后CAT2的表达量上升为对照的1035倍;处理72 h其表达量下降至与对照持平。

3  讨  论

CAT基因家族由多基因编码，曾在烟草、拟南芥、玉米、南瓜和大米等被子植物中发现3种过氧化氢酶[8-12]。本研究从N. tabacum var. NC89叶片成功克隆获得CAT2基因的cDNA序列，对全长cDNA序列进行预测分析发现NC89 CAT2有1479 bp完整的读码框（ORF），可编码492个氨基酸;预测分子质量为56.41 kDa，等电点（pI）为6.87。通过Neighbor-Joiniing（N-J邻接法）NC89和白花单叶烟草的CAT2同源性高。

已有研究表明，CAT2基因家族的表达具有组织和器官特异性。在正常生长条件下，CAT2在发芽后的盾片表达丰富，而在叶片和上胚轴表达量较低[13];在南瓜中，CAT2在绿色子叶、成熟叶、茎和绿色胚轴都有表达[8]。拟南芥CAT2在花序和种子内都表达[14]。本研究结果为CAT2基因在烟草NC89的根、茎、叶、花瓣、花萼、种子中都有表达，而CAT2在花萼组织中表达量最高，花瓣和叶片次之，在根、茎、种子中表达量较低，其中根组织表达量最低。本研究结果表明，NC89 CAT2基因的表达具有组织和器官特异性，CAT2在叶、花瓣、花萼中表达量丰富，可能与植物地上部的光呼吸产生的H2O2清除有关，而对于地下部的光呼吸产生的H2O2清除则可能与其他同源基因的表达有关。

机械损伤胁迫可以显著提高CAT2表达量。在玉米未成熟的种子中，机械损伤处理能够诱导提高3种CAT基因表达量;而在成熟叶片中，仅有CAT1和CAT3表达量提高，都在处理12 h后表达量显著提高，CAT基因参与了玉米对损伤的适应[15]。JUNG等[16]研究表明，Norflurazon （NF）诱导玉米CAT2转录水平的提高主要发生在叶内，而在盾片中无明显变化。本研究中，NC89在遭受机械损伤时，CAT2基因家族表达量变化与玉米的CAT2基因表达趋势一致。CAT2在16 h表达量达到最高，从而推测NC89在遭受机械损伤时，CAT2基因与玉米CAT2有同样的功能，与机械损伤过程中H2O2的清除有关。

渗透压处理提高CAT2基因的相对表达量。在盐胁迫条件下大麦等植物体内CAT的活性明显增加[17]，暗示H2O2可能在植物盐胁迫调节过程中起作用，调节CAT基因的表达。但在高盐（400 mmol/L）胁迫下，Bruguiera parviflora的CAT活性下降的同时，伴随着POX和GR活性的增强[18]。本研究中，盐胁迫能够提高NC89 CAT2基因表达量，清除高盐胁迫下产生的H2O2，从而参与高盐胁迫的适应。进而推测CAT2基因随着高盐胁迫时间和浓度的变化，其活性也会有不同的变化，同时还可能伴随着其他抗氧化酶的变化。

低温和高温处理可诱导CAT2基因的表达量提高。拟南芥随着冷驯化时间的延长，叶绿体基质中CAT2的含量都有不同程度地增加[19]，线粒体中富含甘氨酸的RNA结合蛋白（GRP2）通过调节CAT等酶的活性而提高了拟南芥对冷害和冻害胁迫忍耐能力[20]。FARIDUDDIN等[21]发现，高温胁迫导致番茄产量降低，而耐热品种比热敏感品种产量降低少，在耐热品种中CAT酶活性都明显增加。本研究结果与前人研究一致。从而推测，通过提高CAT酶活性能够显著增强植物低温胁迫耐受性。而在高温胁迫过程中，CAT2基因表达量提高说明CAT2基因可能在夏季高温天氣适应过程中发挥着重要作用。

干旱胁迫能够诱导NC89 CAT表达量提高。樟树具有较强的抗旱能力和伤害修复及超补偿能力，在干旱胁迫条件下樟树CAT活性显著增加[22]。抗旱性强的玉米品种，其SOD、CAT、GPX等酶活性较高，研究发现玉米抗旱性与水分胁迫下CAT等保護酶活性呈显著正相关[23]。小麦中CAT2的表达量在受到严重干旱时表达量显著增强[24]。本研究表明在NC89遭受干旱胁迫时，CAT2基因的表达量提高，因此我们推测其在适应干旱条件有着重要作用。

紫外胁迫能够引起CAT基因表达量的变化。在N. plumbaginifolia L.上的研究表明3种CAT基因在受到55 MJ/m2强度的紫外线影响下，表达量变化是不一样的，CAT1基因的表达量受到抑制，而CAT2和CAT3基因能够诱导的表达[25-26]。而有研究表明在胡萝卜中，CAT2基因在紫外处理6 h后能够诱导表达[27]。反义表达CAT的转基因烟草增强了烟草对光的敏感性，叶片在中等光强下即产生坏死斑，光合能力受到抑制[28]。本研究CAT2基因表达量变化，可推测在紫外光胁迫下可能引起NC89叶片光合作用的光失活，而CAT1基因表达受到光抑制，而此时NC89体内H2O2的清除可能由CAT2基因发挥作用。

接种PVY处理提高了CAT2基因的相对表达量[29]。陈学平等[30]研究感染TMV烟草结果表明，抗病品种CAT活力值在处理后与感病品种相比明显低;吴元华等[31]对感病烟草品种NC89接种PVY进行研究，仅在接种后第2天CAT活性比对照略有升高，而后均比对照低，在第6天和第10天CAT活性降低的幅度较大。研究结果表明，敏感植株在接种病毒后前5 d CAT酶活性升高，随后降低。而本研究中随接种PVY时间的变化，NC89 CAT2基因的表达量先上升后下降，处于表达量上调的过程，从而推测其在抗PVY侵染过程中CAT2基因有着重要的作用。

4  结  论

本研究对烟草NC89 CAT2基因初步进行了定量实验，分析了其在不同器官的表达量及生物胁迫、非生物胁迫处理下的表达量差异。通过机械损伤、渗透压、低温、高温、干旱、紫外因子和感染PVY等方法处理并检测CAT2基因表达量的变化，结果显示生物胁迫与非生物胁迫均引起CAT2基因表达

量上调;不同器官（花、叶、根、茎、种子）基因表达量有差异性，其中CAT2基因在花中的表达量最高，在根中的表达量最低。这暗示CAT2基因可能参与了应对胁迫的过程，为深入地研究植物的抗逆机制及利用基因工程技术提高植物对逆境的适应能力和改善生态环境提供了重要理论依据。

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