山柰酚抵抗对乙酰氨基酚引起的肝细胞损伤研究

张伟贤 兰天 董嘉乐

摘要目的：探究山柰酚（KA）抵抗对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝细胞损伤的作用。方法：CCK8法检测KA对肝细胞活性的影响，检测细胞LDH释放比率确定APAP诱导肝细胞损伤模型的浓度和时间;CCK8法检测肝细胞活性，检测肝细胞释放的LDH，观察肝细胞形态评估KA对对乙酰氨基酚诱导肝细胞损伤的影响;Western Blot检测pJNK、JNK、EndoG蛋白表达。结果：本研究采用5 mmol/L APAP诱导肝细胞24 h建立药物肝损伤细胞模型。与APAP组比较，KA组肝细胞细胞的形态明显改善，凋亡细胞明显减少（P<0.01），LDH释放比率明显下降（P<0.001），Western Blot结果表明经KA治疗后，肝pJNK和Endo G蛋白表达明显下调。结论：该研究表明KA通过抑制pJNK和Endo G来抵抗APAP诱导肝细胞凋亡以达到肝细胞的保护作用。

关键词山柰酚;对乙酰氨基酚;凋亡;肝细胞保护

中图分类号：R996文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.008

对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）又名扑热息痛，是常用的解热镇痛药物，也是引起肝功能衰竭最常见的药物。过量的APAP在肝脏经过细胞色素P450酶（主要是CYP2E1、CYP1A2）代谢产生的活性产物N乙酰基对苯醌亚胺（Nacetyl4benzoquinone imine，NAPQI）是损伤肝细胞的毒素[1]。NAPQI过度消耗肝脏还原型谷胱甘肽（Glutathione，rglutamyl Cysteingl+glycine，GSH），并且NAPQI与线粒体膜上蛋白质形成加合物，破坏线粒体结构，进而导致线粒体氧化应激、线粒体功能障碍和核DNA碎片化，导致肝细胞坏死[2，3]，最终大量的肝细胞坏死造成急性肝衰竭。目前N乙酰半胱氨酸（NAcetylLcysteine，NAC）是急性肝衰竭的特定治疗药物，但治疗时间窗口窄，不少患者因缺乏及早发现肝衰竭的诊断标志物而错过治疗的最佳时间，最后导致肝衰竭。对APAP造成肝损伤严重的病例，唯一的治愈性治疗选择是肝移植，而前5年存活率约为70%。因此，临床上急需替代治疗方案[45]。那么，开发早期预防和治疗APAP导致肝衰竭的药物也具有重要的临床意义。

山柰酚（Kaempferol，KA）属于黄酮类化合物，微溶于水，溶于热乙醇、乙醚和碱，广泛分布于韭菜、洋葱、绿豆、南瓜、马铃薯、番茄、草莓等多种蔬菜与水果，以及连翘、迷迭香、金合欢、银杏叶、含羞草、桂皮等传统中草药[6]，近年研究表明，KA具有抗氧化、抗炎、抗癌、解毒等多種药理活性作用[712]，本研究旨在探究KA对APAP诱导肝细胞损伤的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株人肝源细胞株（LO2）由中山大学黄河清教授实验室赠送。

1.1.2药物KA，纯度≥98%（南京朗泽科技有限公司，生产批号：520138）;APAP，纯度≥99%（上海麦克林生化科技有限公司，货号：103902）。

1.1.3试剂与仪器DMEM培养基（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号：21600034，Gibco）;胎牛血清（Hyclone公司，货号：SV30087.01）;青霉素和链霉素溶液（Hyclone公司，货号：SV30010）;CCK8试剂盒（艾美捷科技有限公司，货号：KTC011001）;triton X100（上海生工生物工程有限公司，生产批号：9002931）;LDH试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A0202）;脱脂奶粉（上海生工生物工程有限公司，货号：E306BA0007）;pJNK一抗（武汉博士德生物工程有限公司，货号：BM4380）;JNK一抗（武汉博士德生物工程有限公司，货号：BM4329）;EndoG一抗（Affinity Biosciences公司，货号：DF8541）;HRP标记的山羊抗兔抗体（普洛麦格（北京）生物技术有限公司，货号：W4018）。3111CO2细胞培养箱（Thermo公司）;BDS系列倒置生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）;LEGEND MICRO 17R冷冻高速离心机（Thermo公司）;WD9405B水平摇床（北京市六一仪器厂）;Transblot turbo转膜系统（BioRAD公司）;QB206多用途旋转摇床（上海市其林贝尔仪器制造有限公司）;33000297Q化学发光仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1LO2细胞培养含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。

1.2.2APAP诱导LO2细胞损伤模型建立每孔预先加入100 μL完全培养基，将对数生长的LO2细胞105个/mL的密度接种于96孔板，每个孔100 μL，在细胞培养箱中培养24 h，更换新鲜无血清培养基在培养箱培养12 h。配制0，2.5，5，10 mmol/L APAP的无血清培养基，分别处理12、16、24 h后分别检测上清液和上清液等体积的1% tritonX100溶液裂解细胞，计算LDH释放比率。

LDH释放比率=上清液LDH（上清液LDH+细胞裂解液LDH）×100%

1.2.3CCK8检测KA对LO2细胞活性的影响每孔预先加入100 μL完全培养基，将对数生长的LO2细胞105个/mL的密度接种于96孔板，每个孔100 μL，在细胞培养箱中培养24 h，更换新鲜无血清培养基在培养箱培养12 h。加入不同浓度的KA（0，12.5，25，50，100 μmol/L），每个浓度设置3个复孔，培养箱培养24 h，吸去培养基，每孔加入90 μL无血清培养基和10 μL CCK8溶液，在细胞培养箱3 h后检测酶标仪450 nm吸光度。

细胞存活率=A（加药）-A（空白）（A（0加药）-A（空白）×100%

1.2.4KA对APAP诱导LO2细胞损伤的影响实验分为6组，分别是空白对照组，模型组（APAP：5 mmol/L）、阳性对照组（黄芩苷，Baicalin，缩写BA：10 μmol/L）和KA低、中、高剂量3个实验组（APAP：5 mmol/L，KA：5，10，20 μmol/L）。将对数生长的LO2细胞105个/mL的密度接种于6孔板，每个孔2 mL，细胞培养箱中培养24 h，更换无血清培养基在培养箱培养12 h，确保细胞密度在70%左右，APAP和给药干预24 h，观察肝细胞形态学变化，检测上清液和LO2细胞裂解液LDH，计算LDH释放比率。

1.2.5Western Blot检测pJNK、JNK、EndoG蛋白表达情况按照以上既定的KA对APAP诱导肝损伤的实验方法进行实验，在药物干预24 h后弃掉细胞上清液，PBS轻轻洗涤细胞3次，加入100 μL细胞裂解液（RIPA：PMSF=100∶1），用细胞刷收集细胞到1.5 mLEP管，放冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度，配制相同各组蛋白浓度，制备Western Blot上样样品，每个样品上20 μg蛋白，进行电泳。电泳结束，PVDF膜用甲醇活化5 min，浸入转膜液中10 min，根据仪器的规范转膜方法进行操作，250MA恒流转膜90 min;转膜结束后PVDF膜使用1%TBST洗3次，10 min/次，5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜后4 ℃孵育一抗12 h，pJNK、JNK、EndoG、GADPH抗体（抗体：一抗稀释液=1∶1 000）孵育，TBST洗膜后二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗膜，最后加入化学发光液显影。

1.3统计学方法实验所得数据均用（±s）表示，数据统计由GraphPad Prism 6软件处理，组间比较用单因素t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1CCK8检测KA对LO2细胞活性的影响

为确定KA对LO2的安全浓度范围，本实验用CCK8检测KA（0、12.5、25、50、100 μmol/L）在24 h对LO2细胞的毒性作用，根据细胞存活率要高于90%，因此，选择了低、中、高3个安全浓度（5、10、20 μmol/L）进行后续实验。见图1。

2.2APAP诱导LO2细胞损伤模型的建立

为确定APAP诱导LO2细胞损伤模型的浓度和时间，本实验设计了不同的APAP浓度（0、2.5、5、10 mmol/L）和不同处理时间（12 h、16 h、24 h）双因素，以LDH释放率来确定造模条件。结果表明，APAP濃度为5 mmol/L，时间为24 h时LHD释放比率为40%，数值升高明显而稳定，以此为造模条件进行后续实验。见图2。

2.3KA对APAP诱导LO2细胞损伤的保护作用

LDH释放比率实验结果显示，相比于空白对照组，模型组LDH释放比率明显升高（P<0.001）;阳性对照组对比模型组LDH释放比率更高，3个不同浓度KA处理组的LDH释放比率都有不同程度的下降（P<0.05，P<0.05，P<0.01），呈剂量依赖，以高剂量组的下降最明显，表明KA对APAP诱导的肝细胞损伤有一定的保护作用。见图3A。

形态学观察发现，空白对照组细胞生长良好，密度大，背景清晰，透明度大，遮光性均匀;模型组发生明显的凋亡，细胞数量减少，细胞皱缩变圆;阳性对照组对比模型组细胞形态明显改善，凋亡细胞数量少，大多数细胞呈梭形。相比于模型组，中剂量组和高剂量组细胞状态有所改善，细胞数量有所增加，凋亡细胞数量减少。高剂量组细胞透明度大，背景清晰。表明KA对APAP诱导的LO2细胞损伤有一定程度的保护作用。见图3B。

CCK8检测结果显示，模型组中的细胞存活率明显降低（△△△△P<0.0001），阳性对照组中的细胞存活率对比模型组明显提高（****P<0.0001），3个不同浓度KA（5、10、20 μmol/L）实验组均能提高细胞的存活率（P<0.05，P<0.01，P<0.01），而且呈现剂量依赖性，高剂量的KA提高LO2细胞存活率的作用最大。表明KA对APAP诱导的细胞损伤具有保护作用，与细胞形态学观察结果一致。见图3C。

3.4KA对APAP诱导LO2细胞凋亡的保护作用

Westren Blot结果显示，相对于空白对照组，模型组pJNK和Endo G蛋白表达量都显著上调;对比模型组，阳性对照组pJNK和Endo G蛋白表达都明显下调;与模型组比较，KA低中高组pJNK表达均有下调，高剂量最明显，呈剂量依赖;与模型组比较，高剂量组Endo G表达明显下调。见图4。

4讨论

摄入过量APAP是目前药物性肝衰竭最主要的原因。不少患者因缺乏及早发现肝衰竭的诊断标志物而错过治疗的最佳时间，最后导致肝衰竭。对APAP造成肝损伤严重的病例，唯一的治愈性治疗选择是肝移植，而前5年存活率约为70%。因此，临床上急需替代治疗方案，开发早期预防和治疗APAP导致肝衰竭的药物也具有重要的临床意义。

人肝源细胞（LO2细胞）是筛选保肝药物的常用细胞[13]。本实验建立稳定的APAP诱导LO2细胞损伤的模型，探究不同APAP浓度（0、2.5、5、10 mmol/L）和诱导时间（12、16、24 h）对LO2细胞的损伤程度，发现APAP（5 mmol/L），诱导24 h，LO2细胞LDH释放比率提高到40%，提高值明显且稳定，所以确定5 mmol/L，24 h作为造模条件。CCK8法（Cell Counting Kit8，细胞增殖毒性检测试试剂盒）是可以直接进行细胞增殖和毒性分析的一种方法，该方法广泛应用于药物筛选，细胞增殖测定以及细胞毒性测试等。本实验使用CCK8法检测了KA对LO2细胞活性以确定KA干预LO2的安全浓度范围，实验结果表明，KA在12.5～25 μmol/L的24 h细胞活力在90%以上，因此确定了KA低、中、高3个浓度（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）作为后续实验研究。

LDH可做为肝细胞损伤的标志物，当LO2细胞损伤时会释放LDH到细胞外，此时检测上清液和细胞内的LDH，计算出LDH释放比率，可评估LO2细胞的损伤程度[14]。本研究显示，对比模型组，3个KA干预组的LDH比率明显降低（P<0.05、P<0.01、P<0.001），且具有剂量依赖性。观察各组细胞形态，空白对照组细胞生长良好，密度大，背景清晰，透明度大，遮光性均匀;模型组发生明显的凋亡，细胞数量减少，细胞皱缩变圆;不同浓度KA对LO2细胞有不同程度的保护作用，对中剂量组和高剂量组的保护作用明显，细胞数量有所增加，凋亡细胞数量减少，高剂量组细胞透明度大，背景清晰;CCK8检测结果显示，模型组中的细胞存活率明显降低（P<0.0001），阳性对照组中的细胞存活率对比模型组明显提高（P<0.0001），KA低中高3个剂量组（5、10、20 μmol/L）均能提高细胞的存活率（P<0.05，P<0.01，P<0.01），高剂量组药效为最佳。以上结果表明KA能抑制APAP诱导的LO2损伤和凋亡。

持续的JNK激活循环在APAP诱导的急性肝损伤和细胞凋亡中有着十分重要的作用。过量的APAP在肝脏经过细胞色素P450酶（CYP2E1、CYP1A2等）代谢产生的活性产物NAPQI，NAPQI过度消耗肝细胞中线粒体还原型谷胱甘肽（GSH），随后NAPQI会与线粒体膜上的蛋白共价结合形成NAPQI加合物，导致线粒体功能中度障碍和ROS释放[12]。JNK是一种与应激有关的促分裂原活化蛋白激酶，由活性氧（ROS）激活。其中JNK激活（即JNK磷酸化为pJNK）的幅度和持续时间是造成APAP急性肝损伤的主要因素[11]。JNK激活会加重线粒体障碍，进一步释放ROS，形成JNK激活循环导致线粒体持续损伤。线粒体功能障碍导致ATP下降，最终引发肝细胞死亡;发生功能障碍的线粒体释放核酸内切酶（EndoG）到细胞质中，EndoG转位到细胞核中使DNA断裂诱发细胞凋亡[15]。Western Blot结果显示，KA能抑制pJNK和下调EndoG蛋白表达，提示KA通过抑制JNK激活改善线粒体功能而达到肝细胞的保护作用。

综上所述，KA通过抑制JNK磷酸化，降低肝细胞氧化应激，保护线粒体功能，抵抗DNA断裂诱发细胞凋亡，从而达到保护过量APAP导致的肝细胞损伤;其作用效果可以利用体内实验作进一步验证。KA可作为开发治疗APAP导致肝损伤的潜在药物。

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（2018-12-10收稿责任编辑：徐颖）