兔脾脏成纤维型细胞RS-17系的建立及其生物学特性

罗怡琳 蒙正群 周丽军 王印 姚学萍 杨泽晓 罗燕 耿毅

摘要：采用胰酶消化法培养技术，对乳兔脾脏组织的细胞进行原代培养，从脾脏组织中分离出1株成纤维型细胞，命名为RS-17。通过对细胞传代培养条件优化，细胞标志性蛋白检测，细胞生长曲线分析，细胞核型以及细胞致瘤性等测定，结果显示，RS-17细胞具有血清依懒性，成纤维细胞标志性蛋白检测阳性，具有正常的核型，无致瘤性，且目前细胞传至95代仍可稳定生长。这为RHDV（兔出血症病毒）感染机制等相关研究提供了细胞材料。

关键词：乳兔;脾脏组织;细胞系;生物学特性;

中图分类号：$829.1 文献标识码：A 文章编号：1000-4440（2019）01-0130-06

家兔是具有重要毛用和肉用价值的传统经济动物，在中国畜牧业生产中具有重要地位。兔也是传统的试验模式动物，与小鼠、猴、猪等试验动物相比，体型适中，易操作，且生理结构和调控机制与人类接近，尤其适用于人类心脑血管疾病等研究。

RHDv（兔出血症病毒）从爆发以来，国内外学者相继对该病毒开展了深入研究，在病原学、诊断技术、免疫防控等多方面取得了卓越的进展。但有一个很棘手的问题就是目前对于该病毒尚无稳定的培养细胞系统，国内外的研究者曾用60余种动物的原代细胞和传代细胞培养RHDv，但是均未获得成功。RHDv培养细胞系的缺乏影响着RHDv的细胞侵染机理和防控等方面的研究，所以探寻出1株合适的细胞系会是研究RHDV侵染机制以及防控该病的重要突破。近年来，随着细胞生物学以及肿瘤的大量研究，永生化细胞因为有着培养的均一性、稳定性和操作简便性等一系列的优点逐渐进入人们视野。本研究偶然获得1株可稳定传代的兔脾脏成纤维型细胞，对其培养以及建系，为RHDV的侵染研究提供基础。

1材料与方法

1.1动物

2日龄乳兔，25g 6周龄Balb/c小鼠购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2主要试剂

干粉DMEM、胎牛血清（FBs）购自Gibco公司，胰酶、曲拉通x-100透化液、Hoechst33342购于索莱宝公司，青霉素、链霉素、碳酸氢钠、氯化钾、氯化钠、牛血清白蛋白BSA等购自博大万科有限公司，MTT细胞增殖试剂盒、吉姆萨染色液、秋水仙素購自生工生物工程（上海）股份有限公司，波形蛋白一抗购自武汉博士德公司，角蛋白一抗购自Novus公司，羊抗鼠Alexa Fluor 488二抗购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.5乳兔脾脏原代细胞的培养

原代细胞培养采用酶消化法，在超净工作台处死乳兔，并在75%酒精中浸泡1～5 min，在无菌条件下取出脾脏，放置于装有PBS溶液的培养皿中涮洗，尽量除去组织的血液，转移到有滤网的无菌培养皿，在滤网上用剪刀剪碎组织，加入适量0.25%胰酶消化，用完全培养液进行冲洗，将液体全部吸入15ml离心管中，放置10 min使大的组织块自然沉降，然后将上层培养液转移至底面积为25 cm2细胞培养瓶，于5%cO，培养箱中培养。根据细胞贴壁情况以及生长状态更换培养液，选择生长状态稳定的细胞进行传代培养。

1.6乳兔脾脏细胞的传代培养

待细胞铺满培养瓶80%～90%时，弃掉培养液，用PBS液清洗3次，加入胰酶消化，在显微镜下观察，待细胞回缩变圆时，加入完全培养基进行终止，轻微吹打使细胞完全从壁上脱离，按1：2进行传代培养，观察细胞生长状况以及形态，选取生长状态良好的细胞继续传代培养，每传2代保存一批细胞。在乳兔脾脏细胞进行传代培养的过程中，发现1株生长状态良好的细胞，细胞培养至八代时细胞生长缓慢，将细胞传代转移到另一个细胞培养瓶，细胞继续生长，且生长速度加快，将该细胞株命名为RS-17，并对细胞继续传代培养。

3讨论

长期以来，永生化细胞的建立主要运用于攻克动物疾病研究以及人类医学上的相关难题。辐射以及病毒转染会促使永生的细胞在生长特性以及生物学特性上都会有所改变，而通过端粒酶转染的细胞保持着正常细胞的特点，所以近20年通过端粒酶建立了大量的人类器官的永生化细胞，如人的视网膜上皮细胞、输卵管上皮细胞、神经干细胞、成纤维细胞等。同时，大量的动物永生化细胞也通过该方法进行建立，veitonmaki等将hrrERT转入牛毛细管内皮细胞，将细胞内源性的p16INK4a/p Rb灭活，而使细胞发生永生化。洪海霞等、苏正元等通过转染hTERT质粒构建了猪的血管内皮细胞。本研究中的细胞在培养至8代后，细胞在14 d内基本停止增殖，当把细胞通过胰酶消化转移到新的培养瓶时，细胞开始生长，且生长速度加快，生长能力以及形态随着细胞的继续传代未有明显改变。而培养了几批次的原代细胞都在传至7～9代就开始生长缓慢，传至10～11代细胞停止生长开始脱落。目前RS-17细胞已传至95代仍形态稳定，完全超过了细胞正常的生长周期以及传代次数，说明RS-17细胞在体外培养的过程中经过自发或外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离而达到了永生化。啮齿类动物细胞自发永生化的几率为10-610-5、0～10-6，这不是第1个乳兔细胞在自然状态下达到永生化的案例，1992年，吉传义等在培养乳兔肾原代细胞的过程中，也偶然获得了1株转化的上皮细胞系。

RS-17细胞在培养过程中，贴壁后前期细胞密度小，细胞多为突起的纺锤形以及扁平星形，后期细胞增殖变多后形态主要为梭形，根据形态可初步认定其为成纤维型细胞，进行免疫荧光染色显示细胞波形蛋白阳性，参照相关研究结果，鉴定该细胞属于成纤维型细胞。在细胞生长曲线测定中，可见随着细胞增殖密度加大，有细胞脱落死亡，同时细胞无重叠生长状态出现.显示细胞具有正常的生长特性，且具有接触抑制性，MTI检测血清依赖性试验中，3%的血清培养基相对于无血清培养基有着极显著的促进生长作用，而与5%、10%的血清培养基之间促进作用无显著差异，说明3%、5%血清培养基可以作为RS-17细胞的培养基：核型观察细胞染色体为44条，这与家兔的染色体条数一致，且选取了2个传代次数的细胞，在染色体数目上没有明显变化，说明RS-17细胞具有正常的染色体，细胞在注射小鼠后没有体现出致瘤性。以上试验结果表明该细胞已经建系成功，为后续RHDV侵染相关研究提供了科学材料。