猪繁殖与呼吸综合征类NADC30与HP-PRRSV毒株RT-PCR鉴别方法的建立与应用

徐雷 赵军 杨晓宇 殷鑫欢 张继宗 朱玲

摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRsv）是一种能够引起大面积呼吸道疾病并快速传播，导致母猪流产和仔猪死亡的RNA病毒，其特性为变异快，存在毒株间的重组。因此，病原的快速检测和鉴定对于该病的防控十分重要。本试验建立了一种能够区分类高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADc30与HP-PRRsv毒株的检测方法，根据nsp2基因的高变区的比对结果，选择其保守序列，设计一对检测引物，类NADc30扩增片段大小为334 bp，HP-PRRsv毒株扩增片段大小为514bp，通过优化反应条件，最终建立了一种一对引物就可以区分检测类NADc30与HP-PRRsv毒株的RT-PcR检测方法。应用本试验所建立的RT-PcR方法对2017年12月至2018年2月采至四川多地区的疑似PRRsv感染发病的46份肺脏进行检测。结果显示，类NADc30检出率为32.6%，高于HP-PRRsv毒株的检出率（10.9%）。该方法的建立，为类NADc30和HP-PRRsv毒株的快速鉴别诊断提供了方法，具有重要意义。

关键词：

猪繁殖与呼吸综合征;类NADc30;HP-PRRsv;鉴别诊断;RT-PcR

中图分类号：s828 文献标识码：A 文章编号：1000-4440（2019）01-0109-05

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV）属于动脉炎病毒科，有囊膜，是单股正链RNA病毒，基因组约长13～15kb。自1987年被首次报道时就一直是影响养猪业健康发展的呼吸道疾病和繁殖障碍的传染性疾病，1996年郭宝清等首次从流产胎儿中分离出PRRSV，证实中国成为了PRRSV流行区域，随后暴发猪繁殖与呼吸综合征，然后发展成为高致病猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic porcine repro-ductive and respiratory svn&ome.HP-PRRS）.并且逐步向全国蔓延。在2008年，美国暴发猪呼吸道疾病，并分离出病毒命名为NADC30，2013年，在中国河南首次发现了类NADC30，在2017年四川大面积暴发母猪流产，断奶仔猪表现为呼吸困难，经检测发现病原是类NADC30。仔猪和育肥猪伴随有间质性肺炎，出血性肺炎等症状，PRRSV通常导致免疫功能障碍，伴随细菌感染，可能会有胸腔积液并形成绒毛心，病死率较高，母猪表现为流产。由于PRRSV会发生自身重组和缺失，造成近年来在中国流行毒株不断发生变异，并形成很多新基因亚型和新型毒株，加之外来毒株传入中国，虽然根据流行病学和临床症状能够确定感染PRRSV，但是HP-PRRSV毒株的疫苗对类NADC30交叉保护效果差，因此，病毒的鉴别对该病的控制非常重要。

PCR方法是鉴定PRRSV毒株的有效方法，目前已建立了类NADC30和HP-PRRSV毒株单一的PCR检测方法。在实际生产中，一旦发现2个毒株同时感染或者单一毒株感染时，使用单一PCR对其进行检测就会出现操作麻烦，时间长，成本增加等缺点。因此，建立一种一对引物即可区分HP-PRRSV毒株和类NDAC30的RT-PCR将使诊断更加方便，本研究拟通过设计一对特异性引物，能够以类NADC30和HP-PRRSV毒株为模板，扩增出不同条带，能够快速有效地对类NADC30和HP-PRRSV进行鉴别检测。

1材料与方法

1.1病毒和病料

类NADC30（NADC30-1ike virus）、HP-PRRSV、猪瘟病毒（Classical swine fever，CSFV）、细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、日本乙型脑炎病毒（Jap-anese encephalitis virus，JEV）、轮状病毒（Rotavirus，RV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritis virus，TGEV）均由四川农业大学动物生物技术中心保存。病料（肺）采自四川眉山、遂宁、宜宾、泸州、自贡等各市规模化养猪场。

1.2主要试剂

2xTaq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000购自北京天根生化科技有限公司：RNAiso Plus、Prime-Script RT Kit购自大连宝生物工程有限公司。

1.3引物设计与合成

根据GenBank中已发表的类NADC30毒株基因组序列（JN654459.1、KF724397.1、KF724398.1等）和HP-PRRSV株基因组序列（EUl06888.1、EU236259.1、EU236259.1等），通过MEGA对比，选取nsp2的保守序列，运用Primier premier5.0设计引物，并采用NCBI网站上的blast方法，进行比对其特异性，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

2.4重复性试验

用所建立的RT-PCR鉴别方法对同一阳性模板进行检测，结果显示模板6次扩增出来的目的条带完全相同（图5），证明该方法具有很好的重复性。

2.5临床应用

采用本试验建立的方法对采自四川眉山、遂宁、宜宾、泸州、自贡等地的46份流产胎儿肺脏进行检测。显示检出类NADC30阳性15份，阳性率32.6%。检出HP-PRRSV阳性5份，阳性率10.9%。与孙英峰等。建立的能够区分HP-PRRSV、類NADC30的PCR检测方法相比较，类NADC30检测的一致性为93.3%（14/15），HP-PRRSV检测的一致性为100%（5/5）。

3讨论

PRRSV作为能够引起呼吸和繁殖方面疾病的病毒，可通过呼吸道传播，猪的规模化养殖模式为PRRS大规模爆发提供了潜在条件，一旦暴发，传播迅速，导致大量仔猪死亡，会造成严重的经济损失。PRRSV灭活疫苗存在安全性和免疫效果差的问题，且不能引起细胞免疫，为避免PRRS发生，规模化猪场普遍使用PRRSV弱毒疫苗对猪群进行防控，但是目前PRRSV弱毒活疫苗存在安全性问题，弱毒活疫苗对PRRSV有较好的防控效果，但是存在毒力返强，导致猪场发病;虽然同源毒株制成的疫苗可以形成交叉保护，但是不同毒株所制成的疫苗则不行：亲缘性高的毒株容易在猪体内进行基因重组，形成重组毒株。中国西南地区流行的主要是HP-PRRSV，但是在2017年下半年，HP-PRRSV检出率低，但是出现持续性暴发母猪流产，保育猪存在呼吸道疾病等问题，但是没有检测出圆环病毒和伪狂犬病毒。HP-PRRSV和类NADC30混合感染时，单一的PCR方法鉴别HP-PRRSV与类NADC30，耗时，操作步骤多，成本增加。

由于国内流行毒株的重组或缺失变异以及毒株的多样性，导致呼吸道疾病多样化，一旦发病，防控困难，将会给养殖场带来极大的损失。因此，对当前的猪繁殖与呼吸综合征进行临床监测和分子流行病学调查十分必要，及时了解当前流行的毒株，以进行实时监控，这样才能够对疫情进行及时的防控。本研究根据最近四川部分地区的流行毒株建立类NADC30和HP-PRRSV毒株的RT-PCR鉴别方法，可以快速有效鉴别类NADC30和HP-PRRSV，其方便、灵敏、准确、省时等优点，对于临床诊断及流行病学调查具有重要意义。