柴芩清热口服液微生物限度检查方法适用性试验

2019-09-10王丹裴斯彪彭贤东唐志立郭廷东潘良平

世界中医药 2019年12期

王丹裴斯彪彭贤东唐志立郭廷东潘良平

摘要目的：建立柴芩清熱口服液微生物限度检查方法，并对5个不同批次柴芩清热口服液微生物限度进行适用性试验。方法：根据2015版《中华人民共和国药典》制备金黄色葡萄球菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、大肠埃希菌菌液、白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液和铜绿假单胞菌菌液;而后采用氯化钠胰蛋白胨稀释液制得1∶10的柴芩清热口服液供试品溶液;根据药典中微生物限度检查法，一步一步建立方法学，即进行计数方法适用性试验和控制菌检查试验，并重复3次进行反复验证，对柴芩清热口服液中微生物的含量进行检测。结果：1）需氧菌总数的计数中：采用薄膜过滤法微生物限度适用性试验研究，柴芩清热口服液需氧菌的菌株回收率计数试验结果显示：金黄色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、铜绿假单胞菌的菌株回收率计数分别为1.02、0.99、0.84、0.96、0.99。2）霉菌和酵母菌计数中结果显示，白色念珠菌和黑曲霉的菌株回收率分别是0.89和0.89。3）柴芩清热口服液在常规法检测控制菌适用性试验结果中显示，每1 g柴芩清热口服液供试品中可能的菌数（102

关键词柴芩清热口服液;薄膜过滤法;大肠埃希菌;金黄色葡萄球菌;白色念珠菌;黑曲霉;铜绿假单胞菌;枯草芽孢杆菌;微生物限度;适用性试验

Applicability Test of Microbiological Limit Test Method for Chaiqin Qingre Oral Liquid

Wang Dan1，2， Pei Sibiao2， Peng Xiandong2， Tang Zhili2， Guo Tingdong2， Pan Liangping2

（1 Second Clinical Medical College， North Sichuan Medical College， Nanchong 637000， China; 2 Department of Pharmacy， Nanchong Central Hospital， Nanchong 637000， China）

Abstract Objective：To establish a microbiological limit test method of Chaiqin Qingre Oral Liquid and to test the applicability of 5 different batches of Chaiqin Qingre Oral Liquid.Methods：Staphylococcus aureus， Bacillus subtilis， Escherichia coli， Candida albicans， Aspergillus Niger and Pseudomonas aeruginosa were prepared according to the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia.Then the sample solution of Chaiqin Qingre oral liquid was prepared by sodium chloride tryptone dilution solution at 1：10.According to the microbial limit test method in Pharmacopoeia， the methodology was established step by step， that is， the applicability test of counting method and the test of control bacteria.The content of microorganism in Chaiqin Qingre oral liquid was detected by repeated verification for 3 times.Results：1）In the count of aerobic bacteria， the applicability test of microbial limit by membrane filtration was carried out.The results showed that the recovery rates of Staphylococcus aureus， Candida albicans， Bacillus subtilis， Aspergillus Niger and Pseudomonas aeruginosa were 1.02， 0.99， 0.84， 0.96， 0.99， respectively.2）The recovery rates of Candida albicans and Aspergillus Niger were 0.89 and 0.89， respectively.3）The results of the applicability test of Chaiqin Qingre oral liquid in the routine method showed that the possible number of bacteria per 1 g of Chaiqin Qingre oral liquid was（102

Key Words Chaiqin Qingre oral liquid; Membrane filtration method; Escherichia coli; Staphylococcus aureus; Candida albicans; Aspergillus Niger; Pseudomonas aeruginosa; Bacillus subtilis; Microbial limit; Applicability test

中图分类号：R286.0文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.009

柴芩清热口服液我院的院内制剂，主要运用于上呼吸道感染的治疗，患者多出现咳嗽流涕、咽痛鼻塞等症状，属于中医学中“风热感冒”的范畴[1]，柴芩清热口服液的主要药物组成有山银花、薄荷、法半夏、柴胡、连翘、芦竹根、黄芩、青蒿、荆芥、板蓝根等。制作成口服液的形式，主要是考到到患者服用时的便利性和便携性。我国2015版《中华人民共和国药典》对口服制剂的微生物限度要求为，所检测样品中细菌、霉菌、酵母菌的所有菌数总和必须低于10 cfu/mL，不得检出大肠埃希菌和大肠菌群[2-3]，基于此，本研究就柴芩清热口服液进行微生物限度检查，采用薄膜过滤法入手对柴芩清热口服液中白色念球菌、黑曲霉、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的验证回收率进行展开研究，而后进一步以大肠埃希菌直接检查法进行微生物限度适用性试验研究。现具体报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器苏净二级全排风生物安全柜（上海苏净实业有限公司，型号BSC-1600IIB2）;全封闭式集菌仪（上海乔跃电子有限公司，型号ZW-2008）;四川隔水式恒温培养箱（成都市苏净科学器材有限公司，型号BG-80）;型霉菌培养箱（重庆市松朗电子仪器有限公司，型号JC-250F-I）。

1.2 试剂 MUG营养琼脂培养基（NA-MUG，产品号：CM1517）、胰酪大豆胨培养基（产品号：CC-1411-25）和沙氏葡萄糖培养基（产品号：HB0110-6）购买于北京世纪奥科生物技术有限公司。改良马丁培养基（青岛海博生物有限公司，产品号：HB5222）;营养肉汤培养基（产品号：HB0108-4）、胆盐乳糖培养基（产品号：PX010224）、营养琼脂培养基（产品号：HB0109-7）和氯化钠胰蛋白胨稀释液（产品号：PX011018）购于北京谱析科技有限公司。

1.3 菌种金黄色葡萄球菌菌株（产品号：PX50254）、枯草芽孢杆菌菌株（產品号：PX50222）、大肠埃希菌菌株[产品号：CM-CC（B）44102]、白色念珠菌菌株（产品号：PX50240）和黑曲霉菌株（产品号：PX50241）均购买于北京谱析科技有限公司;铜绿假单胞菌菌株[产品号：CMCC（B）10104]购买于中国食品药品检定研究院。

1.4 分析样品选择5个不同批次的柴芩清热口服液（川北医学院附属南充市中心医院，批准文号：川药制字Z20080285）。

2 方法

2.1 菌液的制备 1）所有菌液的制备均严格按照2015年版《中华人民共和国药典》一部附录重的具体要求进行操作[4-6]，其中金黄色葡萄球菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、大肠埃希菌菌液和铜绿假单胞菌菌液的制作均是，分别将金黄色葡萄球菌菌株、枯草芽孢杆菌菌株、大肠埃希菌菌株和铜绿假单胞菌菌株接种到胰酪大豆胨液体培养基中，经过24 h培养箱（30～35 ℃）的培养后，精密吸取1 mL菌悬液，并采用0.9无菌氯化钠溶液将其配制成合适的菌悬液浓度。在控制菌验证中中，在此基础上制成菌悬液含有的菌落数均<100 cfu/mL。2）白色念珠菌菌液的制备是将白色念珠菌株接种到沙氏葡萄糖液体培养基中，经过2～3 d霉菌培养箱（20～25 ℃）的培养后，精密吸取1 mL菌悬液，并采用0.9无菌氯化钠溶液将其配制成合适的菌悬液浓度。在控制菌验证中中，在此基础上制成菌悬液含有的菌落数均<100 cfu/mL。3）黑曲霉菌液的制备是将黑曲霉菌菌株接种到沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面上，经过5～7 d霉菌培养箱（20～25 ℃）的培养后，精密吸取1 mL菌悬液，并采用（0.9无菌氯化钠溶液+0.05（v/v）吐温80）将其配制成合适的菌悬液浓度。在控制菌验证中中，在此基础上制成菌悬液含有的菌落数均<100 cfu/mL。

2.2 供试品溶液的制备首先将氯化钠胰蛋白胨稀释液调到pH值7.0时，精密量取柴芩清热口服液10 mL，加入氯化钠胰蛋白胨稀释液至100 mL并剧烈振摇，重复混合均匀制得1∶10的柴芩清热口服液供试品溶液。

2.3 柴芩清热口服液计数方法适用性试验

2.3.1 需氧菌总数的计数采用薄膜过滤法将10 mL柴芩清热口服液供试品溶液放入经灭菌后的试管中，加入0.1 mL相应的需氧菌试验菌液，严格根据2015版《中华人民共和国药典》使其终浓度的菌落数<100 cfu/mL，经过不断吹打充分混合菌液后，取1 mL注入都100 mL无菌氯化钠-蛋白胨（pH值7.0）中，通过缓慢滤过和多次粉刺冲洗抽干后，采用镊子取膜，并轻贴于胰酪大豆胨琼脂平板上，以倒置培养的方式进行培养，并测定菌落数。计数公式为：各菌株回收率=[（观察组的菌落平均数-供试品对照组的菌落平均数）/菌液对照组的菌落平均数]。见表1。

2.3.2 霉菌和酵母菌的计数将10 mL柴芩清热口服液供试品溶液放入经灭菌后的试管中，加入0.1 mL相应的菌液，严格根据2015版《中华人民共和国药典》[7]，使其终浓度的菌落数<100 cfu/mL，经过不断吹打充分混合菌液后，取1 mL注入100 mL无菌氯化钠-蛋白胨（pH值7.0）中，通过缓慢滤过和多次粉刺冲洗抽干后，采用镊子取膜，并轻贴于沙氏葡萄糖琼脂平板上，以20～25 ℃的培养温度进行培养，并测定菌落数。计数公式为：各菌株回收率=[（观察组的菌落平均数-供试品对照组的菌落平均数）/菌液对照组的菌落平均数]。见表2。

2.4 柴芩清热口服液检测控制菌试验根据控制菌检验方法[8-9]，首先采用移液管将10 mL柴芩清热口服液供试品溶液放入经灭菌后的试管中，加入0.1 mL相应的大肠埃希菌菌液，使其终浓度的菌落数<100 cfu/mL，经过不断吹打充分混合菌液后，取1 mL注入都100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，并严格根据2015版《中华人民共和国药典》[7]中控制菌检验方法检查。见表3。

2.5 5個不同批次柴芩清热口服液样品检测结果5批柴芩清热口服液的微生物计数结果显示需氧菌总数、霉菌总数和酵母菌总数均<10 cfu/mL，而在控制菌检查试验结果中5批柴芩清热口服液中大肠埃希菌均未检出。见表4、表5。

3 讨论

柴芩清热口服液处方中主要药物组成为山银花、薄荷、法半夏、柴胡、连翘、芦竹根、黄芩、青蒿、荆芥、板蓝根等;其中黄芩苷、连翘、柴胡和山银花均具有较强的抑菌性，研究发现黄芩苷具有体外抑菌的作用[10-12]，该研究中主要选择的菌种为金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌等，结果发现黄芩苷对这些菌均有明显的抑制作用，且对革兰氏阳性菌的抗菌作用强于对革兰氏阴性菌的抗菌作用;薄荷对霉菌具有明显的抑制作用[13];而其中具有较强抗菌作用和较广抗菌谱的当属柴胡，研究发现[14-16]柴胡能够有效抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和溶血性链球菌等，对痢疾杆菌和白色念珠菌也有一定的抗菌作用;山银花具有抗病毒的作用，同时板蓝根的抗菌研究中发现其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿脓杆菌均由不同程度的抑制作用[17-19]。虽然从柴芩清热口服液的主要成分中可窥见其抑菌性，但仍必须按照《中华人民共和国药典》有关规定要求进行微生物限度的适用性试验，以科学的方法和态度保证柴芩清热口服液药物的安全性。

微生物限度检查法在细菌计数试验的过程中可能有明显抑菌的品种，在控制菌的检查过程中可以采用直接接种法、培养基稀释法和薄膜过滤法，其中最为方便常用的直接接种法就能检出试验菌株，如果存在对抑菌活性较强而常规方法不能排除的制剂品种，则多选用薄膜过滤法。我们在柴芩清热口服液微生物限度试验研究过程中，在比较选用直接接种法、培养基稀释法和薄膜过滤法进行了试验，发现前2种试验方法均存在干扰现象，而采用薄膜过滤法取得的测试结果干扰性较小，进一步加强了本研究结果的客观性，为使本研究检查结果获得良好的

准确性和重复性，不仅保持等量的培养基注入体积，且均采用薄膜过滤法进行检测和验证，每次验证需进行3次独立完整的平行试验。

为了减少微生物限度检查中的干扰因素，故本研究采用逐层递进的研究方法进行研究。首先采用的是需氧菌总数计数，菌株回收率计数试验结果显示：金黄色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、铜绿假单胞菌的菌株回收率计数分别为1.02、0.99、0.84、0.96、0.99。紧接着对霉菌和酵母菌总数进行检测，霉菌和酵母菌计数中结果显示，白色念珠菌和黑曲霉的菌株回收率分别是0.89和0.89。值得注意的是，在2015版的《中华人民共和国药典》中菌株回收率是用数值表示而不是百分比，药典中规定回收值在0.5～2.0之间均属于合格的范畴;这点有别于2010版《中华人民共和国药典》，其采用的是百分比的形式来表示菌株回收率，并规定当菌株回收率不低于70%时才符合合格的标准。而在5个不同批次的柴芩清热口服液需氧菌总数<10，符合2015版《中华人民共和国药典》中<102的规定，5个不同批次柴芩清热口服液霉菌和酵母菌总数均<10，也符合2015版《中华人民共和国药典》中<101的规定;且5个不同批次柴芩清热口服液中均未检出大肠埃希菌。研究结果符合2015版《中华人民共和国药典》对口服液制剂的微生物限度的规定。

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