绵羊肺炎支原体感染的诊断和防治技术研究进展

江锦秀 林裕胜 张靖鹏 游伟 黄丽丽 胡奇林

摘要：绵羊肺炎支原体（Mo）是引起绵羊和山羊支原体性肺炎的主要病原之一，呈世界性分布，给世界羊养殖业带来巨大经济损失。Mo的检测方法主要有3类：一是病原分离鉴定法，分离率低;二是分子生物学方法，包括PCR方法、LAMP方法、降落PCR-侧向层析快速检测方法、DNA探针技术，分子生物学方法是目前检测致病性支原体最为常用的方法;三是免疫学检测方法，包括间接血凝方法、ELISA方法、免疫组织化学及间接免疫荧光。Mo的防治主要是疫苗和药物治疗，

目前临床用的疫苗主要以灭活疫苗为主，基因工程疫苗是未来的发展趋势;Mo的治疗主要包括抗生素治疗、中药治疗、中西医结合治疗，近几年有报道称免疫防御分子对Mo患病羊有免疫调节和治疗作用，为Mo引起的肺炎的治疗提供了新方向。本文对Mo感染的流行病学、诊断方法、防治方法及疫苗研究进行了系统综述，以期为我国羊支原体性肺炎的研究和防治提供参考。

关键词：绵羊肺炎支原体;流行病学;诊断方法;防治;疫苗

中图分类号：S855.1文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2019）12-1463-08

0 引言

綿羊肺炎支原体（Myc0Plasma ovzpneumoniae，Mo）属于柔膜体纲、支原体目、支原体科成员，是羊支原体性肺炎的主要病原之一，主要引起绵羊和山羊的肺炎。Mo无细胞壁，菌体形态多样，菌体直径约0.1-0.5um，在施加外部压力情况下可通过0.22um滤膜。Mo生物合成及代谢能力较弱，对培养基营养要求高，生长需要胆固醇，能够利用环境中的葡萄糖进行发酵。Mo基因组为双链DNA，基因组大小在1020-1084kb，不同毒株CDS不同，Y98标准株有819个CDS，SC01株有864个CDS，NM2010株有748个CDS。分离自不同地域与宿主来源的Mo存在高度的基因多态性。不同Mo分离株的主要免疫原性蛋白也存在一定差异。溶血素A（h1YA）、溶血素C（hlyC）、3-磷酸甘油脱氢酶（GlpD）、丙三醇激酶基因（glpK）、水甘油通道基因（glpF）、P102蛋白、P146蛋白、P97蛋白、P76蛋白是Mo SC01株可能的毒力因子。另有报道荚膜多糖也是Mo另外一个重要的毒力因子。Mo感染在全世界养羊国家都有发生，在我国新疆、内蒙古、山东、河南、四川、浙江、福建等多个省市均有报道，导致了严重的经济损失。对Mo感染做出及时、准确的诊断及防治对控制该病尤为重要。本文将阐述Mo感染的流行病学、检测方法、疫苗研究以及治疗技术的研究进展，以期为Mo感染的研究和防治提供参考。

1Mo流行病学特征

Mo可以侵害山羊和绵羊，一年四季均可发病，冬春季节羊感染Mo的发病率比夏秋高。各日龄羊均可发病，以3月龄以下的羔羊为主。Mo对不同品种羊的感染率不同，Mo对绵羊感染率比对山羊的感染率高，Mo对湖羊的感染率比对哈萨克绵羊、麦兰奴种绵羊和新疆多浪羊的感染率高。Mo感染的羊在临床上的主要特征是高热、流鼻涕、咳嗽、纤维素胸膜肺炎，发病率因地域和养殖模式而有所不同，发病率为5%-80%，病死率达30%-100%。Mo感染羊的症状与丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp.capri，Mine）、山羊支原体山羊亚种（Mycoplasma capricolum capricolum，Mcc）、山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumonia，Mccp）感染羊的症状相似。我国最为普遍流行的是Mo，羊群中同时存在Mo与Mccp或Mmc混合感染的情况，仅根据流行病学特点、临床症状和病变难以做出确诊，需要进一步检测。

2 Mo诊断方法

2.1病原分离鉴定法

分离鉴定法是检测Mo的金标准。目前Mo培养基大多是采用改良的Thiaucourt's培养基（Modified了hiaucourt’s medium，MTS）、改良KM2培养基（MEM-KM2）、改良的Hayflick培养基、改良支原体肉汤培养基等。胸水是首选的Mo分离材料，其次为肺部病健交界处组织和鼻拭子。培养基的pH一般为7.6-7.8。对CO浓度的要求为5%-10%，可用37℃烛缸厌氧培养箱或者CO培养箱培养。Mo在液体培养基中一般要盲传1-3代才能看到颜色变化，在固体培养基上长出白色菌落，Mo的支原体菌落没有中心脐，可区别于丝状支原体簇成员。对菌落进行显微镜观察、生化鉴定、PCR等能进行鉴定。首次分离可以同时接种固体和液体培养基以提高分离率。临床上抗生素的使用以及Mo的培养条件要求苛刻，致使支原体分离率比较低，并且Mo分离鉴定法耗时长，不适合Mo的早期快速检测。

2.2 分子生物学方法

2.2.1PCR方法PCR方法是Mo检测方法中最为常用的方法，其阳性检出率高于分离鉴定法和免疫组化方法。Falong Yang等基于热休克蛋白hsp70基因建立了检测Mo的PCR方法，检测下限为4.4pg，其敏感性是基于Mo 16SrDNA基因建立的PCR检测方法的10倍。储岳峰等根据Mmc保守的CAP-21基因和Mo 16SrRNA基因分别设计特异性引物，建立了Mmc和Mo的双重PCR方法。林裕胜等根据Mo的P80基因、Mmc的MLC-1760基因和Mccp的arcA基因序列，设计合成了3对特异性引物，建立了同时检测Mo、Mmc和Mccp的多重PCR方法。林裕胜等针对Mo Y-98标准株黏附素基因p113基因序列设计1对特异性引物和探针，建立了针对Mo的TaqMan荧光定量检测方法，其敏感性是传统PCR的1000倍。Falong Yang等针对p113基因建立了SYBR Green荧光定量检测方法，其敏感性是基于Mo 16S rDNA基因建立的PCR检测方法的1000倍。

2.2.2LAMP方法 张双翔等针对Mo的16S rRNA基因设计4条环介导等温扩增（LAMP）引物，通过优化反应温度和反应时间、优化内外引物浓度以及反应体系，建立了Mo LAMP方法。LAMP-LFD技术是环介导恒温扩增技术（Loop-mediated isothermalamplification）与横向流动试纸条（Lateral flowdipstick）相结合的一种新颖的检测技术。张洁等以Mo的热休克蛋白基因（HSP70）为靶基因，其中HSP70FIP由生物素标记进行LAMP扩增反应，产物与生物素标记的探针杂交后，在横向流动试纸条上完成检测，使得检测结果可视。ZHANG J等也以Mo的延伸因子EF-TU基因为靶基因建立了LAMP-LFD方法，敏感性是传统PCR的1000倍。

2.2.3 降落PCR-侧向层析快速检测方法杜鲜等结合降落PCR（TD-PCR）和侧向层析（LFA）技术建立了Mo的检测方法，将2条特异性引物5’端分别标记地高辛和生物素进行TD-PCR，以胶体金标记抗地高辛抗体复合物，检测线包被链霉亲和素，对照线包被羊抗鼠IgG，组装成试纸条，将TD-PCR产物滴于检测试纸条上，最低检出菌浓度为3×10CCU·mL-1，对Mccp、Mmc、Brucella、E.coli、S.aureus的TD-PCR产物检测结果均为阴性，该方法不但提高了敏感性和特异性，同时还省去了琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像等步骤，2h即可完成。

2.2.4DNA探针技术Chen等以Cy5标记的单链DNA探针结合到MnO微球体，建立了Mo的DNA探针检测技术。检测的灵敏度达到1.042copies·uL，重复性好，稳定性高，简单，快速，经济。文中还通过试验证明了MnO微球体比MnO纳米片有更大的表面积，对单链DNA有更强大的吸收效率，更适合作为单链DNA探针的载体，为其他病原的探针技术的建立提供了参考。

2.3免疫学方法

2.3.1 间接血凝方法赵萍等用纯化的Mo菌体经过20倍浓缩，超声破碎后作为抗原致敏经戊二醛处理的绵羊红细胞，通过摸索最佳抗原浓度建立了Mo间接血凝试验诊断方法，目前该试剂盒（山羊传染性胸膜肺炎间接血凝试验抗原、阳性血清与阴性血清）已经获得国家二类新兽药证书。Mo间接血凝方法已经广泛运用于羊场Mo的血清学调查。

2.3.2ELISA方法候相山、赵萍等都用MoY98标准株培养、浓缩、超声破碎作为全菌包被抗原，建立了间接ELISA方法，证明间接ELISA方法比间接血凝试验具有更高的特异性和敏感性。黄海碧等将Mo抗原表位富集的P71基因片段分3段克隆至原核表达载体，经过免疫原性和反应原性筛选纯化后的P71-3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法，具有很好的特异性和敏感性。程振涛等将Mo HSP70基因进行原核表达，用表达产物包被抗原建立间接ELISA方法，适用于检测羊血清Mo HSP70抗体，能够体现体内Mo感染水平和疫苗免疫水平。基因工程菌表达的蛋白可以进行大批量生产、纯化，相对于全菌蛋白作为包被抗原，解决了Mo培养困难、周期长、滴度不高的问题，而且还避免了全菌蛋白依赖的试剂盒存在的种特异性不足的问题。

2.3.3 免疫组织化学及间接免疫荧光 张建华等采集疑似Mo病羊肺组织，进行石蜡切片和冰冻切片制作，以Mo标准阳性血清为一抗，分别以免抗山羊IgG-HRP和兔抗山羊IgG-FITC為二抗，对疑似Mo肺组织石蜡切片和冰冻切片及阴性对照分别进行免疫组化染色和间接免疫荧光染色，建立了检测Mo的间接免疫组织化学和间接免疫荧光方法，建立的这两种方法对138份样品进行检测，阳性率与PCR结果相近，比分离培养的阳性率高。这2种方法不适合病原的早期检测，操作较为繁琐，不适合大量样品的检测。

Mo感染在临床诊断上易与其他支原体引起的肺炎相混淆，需要结合其他检测方法才能做出确诊。分离培养法对样品要求高而且分离率低，不适合该病的早期诊断。分子生物学方法对样本要求较低，是目前检测Mo最常用、研究最多且高效的方法。LAMP方法由于其对设备要求低，结果可视，非常适合基层养殖场使用。荧光定量PCR方法相对于普通PCR和多重PCR具有更高的敏感性、更省时、结果更为准确。间接血凝试验和间接ELISA方法相对于间接免疫组化和间接免疫荧光试验更适合临床样本量大的血清学调查，ELISA方法敏感性高于间接血凝方法。

3 疫苗研究现状

3.1灭活疫苗

目前国内Mo的疫苗主要是灭活苗，以全菌抗原灭活为主。韩笑等筛选毒力最强的Mo SCO株经培养、浓缩至抗原浓度为10CCU·mL，经甲醛灭活，以1：1加入油佐剂（白油94%、司本6%和1.5%硬脂酸铝）乳化后制备成Mo灭活疫苗，对5只攻毒山羊的保护率为100%。逯忠新等将Mo（MoGH3-3株）和]Vllnc（M87-1株）菌液浓缩后经甲醛灭活后按1：1混合，按抗原总量的万分之一加入硫柳汞做成水相（占疫苗总量的45-50%），加入ISA206油佐剂作为油相，充分搅拌乳化成双相油乳剂疫苗。该疫苗对Mo和Mmc攻毒山羊的保护率达80%以上，一次注射疫苗的有效期达10个月。佐剂和灭活疫苗的处理方式都将影响灭活疫苗的免疫效果，费磊等研究表明ISA-760、Buonavogtial’S佐剂对Mo灭活疫苗的免疫增强效力显著优于ISA-206和白油佐剂。SOMYA MEHRA等以皂素和氢氧化铝作为Mmc灭活疫苗的佐剂的免疫保护率（100%）比单纯用皂素作为佐剂的免疫保护率（75%）高。说明不同佐剂对支原体灭活苗的免疫保护率的影响比较大。KManimaran等用Mmc冻干皂化的全菌疫苗和冻干皂化超声疫苗免疫山羊，通过SAT、IHA、CFT、ELISA测试，发现皂化超声疫苗比全菌疫苗能诱发更强的体液免疫，说明超声处理可以提高灭活疫苗的免疫效果。目前国内的商品化疫苗为山羊支原体肺炎灭活疫苗（MoGH3-3株+M87-1株），可以同时预防Mo和Mnlc。不同地方流行的支原体具有遗传多样性，菌株之间交叉保护力低，另外Mo体外培养产量相对较低，耗时，全菌抗原存在安全隐患，所以研发高效安全的Mo新型疫苗是近年的趋势。

3.2基因工程疫苗

目前许多研究集中在通过抗原表位鉴定筛选具有良好免疫原性的蛋白，用于制备亚单位疫苗。有报道Mo的p128基因、p113基因、p74基因、p56基因等表达的蛋白可以与Mo抗体发生特异结合，具有良好的反应原性，表明P128蛋白、p113蛋白、P74蛋白以及P56蛋白是Mo的免疫相关蛋白。Jiang F等通过用纯化的重组蛋白rEF-Tu和rHSP70免疫BALB/c小鼠来评估体内的体液和细胞免疫应答，证明了Mo的延伸因子Tu（EF-Tu）和HSP70是能够诱导抗体产生和细胞因子分泌的膜相关蛋白，HSP70在小鼠中能诱导更好的細胞免疫应答，并且可以在免疫应答中充当Thl细胞因子样佐剂，这2种蛋白可能是开发Mo疫苗的潜在候选者。MaksimovidZ等研究证明，从绵羊和山羊分离的Mo菌株间存在高度的表型和基因组异质性，然而分子质量为36、38、40和70kDa的免疫显性抗原在绵羊和山羊Mo分离株中均存在，为研究亚单位疫苗奠定了基础。多表位抗原是一种能增强蛋白抗原性的方法，田路路等将P97、P113、延伸因子Tu（EF-Tu）、丙酮酸脱氧酶El-a亚单位（PHDA）等具有免疫原性的优势抗原表位串联，构建多表位融合基因，进行原核表达，结果表明该重组蛋白有良好的反应原性和免疫原性。张轩等通过生物信息学软件预测以及动物试验验证获得了EF-Tu蛋白和PHDA蛋白的4个B细胞表位和2个T细胞表位，将这6个表位与具有免疫佐剂功能的HSP70的C端用连接子进行串联，筛选最优的串联体进行原核表达，并验证了其与Mo免疫血清出现了特异性反应。刘文青等的研究也表明Mo标准株Y98膜蛋白P26-P40基因融合表达的重组蛋白比P26基因和P40基因单独表达的重组蛋白对Mo攻毒小鼠有更高的保护率，同时P26-P40重组蛋白对Mo攻毒绵羊也能起到保护作用。多表位抗原联合表达为Mo新型疫苗的研发奠定了基础。单核细胞增生李斯特菌是近年发展起来的一种新型疫苗活载体，卢海亭等通过同源重组技术将Mop74抗原基因插入单核细胞增生李斯特菌（LM rli60）基因缺失弱毒株基因组中，获得了具有免疫原性的Mo p74基因重组单核细胞增生李斯特菌，为研发Mo重组活载体疫苗奠定了基础。

目前Mo疫苗以灭活疫苗为主，由于Mo菌株存在遗传多样性，同时存在多种支原体混合感染的情况，临床应用效果不够理想。亚单位疫苗较传统灭活疫苗副作用少，多表位串联疫苗有更强的免疫原性，同时可以包含多种抗原表位，可以解决Mo菌株存在的遗传多样性问题，活载体疫苗在增强免疫应答方面具有独特的优势，将是新型Mo疫苗的发展趋势。

4 治疗研究进展

4.1抗生素治疗

Mo属于革兰氏阴性菌，最常见的治疗Mo感染是应用抗生素。2011年，宋勤叶等应用微量法测定了18种常用抗菌药物对Mo分离株HDl-goat和Mmc分离株XTl-goat的抗菌活性，结果这2个分离株均对喹诺酮类抗生素、酒石酸泰乐茵素及盐酸多西环素高度敏感，但是对氨基糖苷类抗生素和磺胺甲恶唑均不敏感，而且同一种抗生素对同一种支原体的不同分离株的抗菌活性有差异。四川地区的33株山羊源Mo对氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类和林可霉素类抗菌药物比较敏感，对氟苯尼考表现出中度敏感，不同Mo菌株的耐药普有所差异，但26株Mo对氯霉素、链霉素、红霉素、头孢噻呋、阿米卡星、利福平均表现出耐药。抗生素对支原体引起的疾病有一定的治疗效果，但是不能根除，并且不同地方分离株对抗生素的耐药性不同，需要根据当地养殖环境及药敏试验来确定用药。而近年来国外有报道Mmc、Mcc、牛支原体（Myeoplasmaboris，Mb）等支原体对喹诺酮类抗生素产生了耐药。因此，随着喹诺酮类药物的反复使用，后期Mo也有可能对喹诺酮类药物产生耐药。

4.2 中药治疗或者中西药结合治疗

中药治疗或者中西药结合治疗可以减少耐药性的产生。陈美安等筛选出两面针、黄连、黄芩、黄柏、甘草、南板蓝根、白鲜皮等7位中药提取物对Mo有不同程度的体外抑制和杀灭作用。温伟等用麻杏石甘汤配合泰乐菌素饮水，外加氟苯尼考和电解多维肌肉注射，对Mo感染羊的治愈率为88.9%。以上研究表明中药对Mo的治疗有较好的效果。

4.3 免疫防御分子治疗

近几年研究表明疾病抗性基因编码的蛋白（免疫防御分子）对感染Mo的病羊有一定的免疫调节作用。多位学者都通过建立人工感染Mo的患病羊模型后，分别注射真核表达的短腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1重组蛋白（Shortpalate，lungandnasalepitheliumclone 1，SPLUNCl）、杀菌通透性增加蛋白基因重组蛋白（bactericidal/permeabilitv-increasing proteingene，BPI）、类泛素15（Interferon stimulated genel5，ISGl5）以及甘露糖结合凝集素（MBL）等蛋白，通过监测相关细胞因子的变化等证实了这4种蛋白对Mo感染的病羊有免疫调节和治疗作用，免疫防御分子在感染性疾病中的作用备受学术界关注，这为支原体的治疗和新药的研制提供了新的思路。

目前Mo的治疗仍以抗生素为主，但由于不同地区抗生素的使用导致不同分离株的耐药谱不同，建议分地区定期对Mo的抗菌活性进行测试以指导临床用药。中药成分复杂，有的成分有毒性作用，体外试验的效果需要临床进一步验证。免疫防御分子对Mo感染的病羊有免疫调节和治疗作用，可以减轻Mo感染羊的临床症状，但并不能完全阻止肺脏实质性病变的发生。Mo引起的肺炎应以免疫预防为主，治疗为辅。

5 结论

Mo感染是当前国内外危害养羊业发展的一种主要疫病，目前以灭活疫苗免疫为主要预防措施，临床上该病的防治效果不佳，应该加强Mo感染的致病机理和免疫机制等研究，研发安全、高效的羊支原体性肺炎疫苗，保障养羊业的健康稳定发展。