芍药甘草滴丸的制备及其芍药苷、甘草苷和甘草酸的HPLC含量测定

王敏 龚慕辛 刘正跃 史赫男 黄秋阳 张芮乾 郭思远 贺蕊

摘要  目的：制备芍药甘草滴丸（SGDP），测定其主要成分芍药苷、甘草苷、甘草酸的含量，以及其他与质量控制相关的指标，为有效控制其质量提供重要指标和参数。方法：采用水煎煮提取，乙醇沉淀、HP-20大孔树脂纯化后，选择合适的基质和冷却剂，制备SGDP;采用HPLC-DAD法测定SGDP中芍药苷（230 nm）、甘草苷（276 nm）、甘草酸（250 nm）的含量。并按照《中华人民共和国药典》2015版的方法对其外观、重量差异、溶散时限进行检查。结果：成功制备了SGDP，HPLC法可同时测定SGDP中芍药苷、甘草苷、甘草酸铵盐的含量，分别是（32.66±0.46）mg/g、（9.23±0.23）mg/g、（17.48±0.86）mg/g;平均回收率分别是111.23%、96.04%、104.43%。外观、重量差异、溶散时限均符合药典要求。结论：SGDP的制备工艺合理可行。HPLC法灵敏、准确可靠，重复性好，可用于同时检测SGDP中芍药苷、甘草苷、甘草酸的含量，为其质量控制提供参考依据。

关键词  芍药甘草滴丸;芍药苷;甘草酸;甘草苷

Preparation of Shaoyao Gancao Dripping Pills and Determination of Its Main Contents of Paeoniflorin，Liquiritin and Glycyrrhizic Acid by HPLC Method

Wang Min，Gong Muxin，Liu Zhengyue，Shi Henan，Huang Qiuyang，Zhang Ruiqian，Guo Siyuan，He Rui

（School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Abstract Objective： To prepare Shaoyao Gancao Dripping Pills （SGDP） and determine its main contents of paeoniflorin，liquiritin and glycyrrhizic acid by HPLC Method，and to provide important reference and parameters for the effective quality control of SGDP. Methods： SGDP was prepared by water decoction，ethanol precipitation and purification of HP-20 macroporous resin.The main contents paeoniflorin，liquiritin and glycyrrhizic acid of SGDP were determined by HPLC-DAD methods at 230 nm，276 nm and 250 nm，respectively.The appearance，weight difference and solution time were determined according to Chinese Pharmacopoeia （2015）. Results： SGDP was successfully prepared and the main contents of paeoniflorin，liquiritin and glycyrrhizic acid ammonium salt of SGDP were （32.66±0.46） mg/g，（9.23±0.23） mg/g，and （17.48±0.86） mg/g，respectively，and could be detected simultaneously by HPLC method with mean recovery rate of 111.23%，96.04% and 104.43%，respectively.The indexes of appearance，weight difference and solution time were consistent with the standards of the pharmacopoeia. Conclusion： The preparation techniques of SGDP was rational and practicable.HPLC method was sensitive，accurate，and reproducible.It could be used to determine paeoniflorin，liquiritin and glycyrrhizic acid of SGDP simultaneously and provide important reference for the quality control of SGDP.

Key Words  Shaoyao Gancao Dripping Pills; Paeoniflorin; Glycyrrhizic acid; Liquiritin

中圖分类号：R932;R944.9 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.013

芍药甘草滴丸（Shaoyao Gancao Dripping Pills，SGDP）是由《伤寒论》中的芍药甘草汤剂型改造而成。芍药甘草汤药虽仅有两味中药组成，但其结构严谨，配伍精当，为后世医家所推崇，具有确切的镇痛、抗炎作用[1-2]，也可治疗脾胃病[3]。临床研究[4-5]和越来越多的基础研究[6-8]表明其具有确切的防治哮喘的作用，主要与其抗炎、解痉、平喘的作用有关[4，9]。芍药甘草汤对哮喘患者[4-5]、大鼠[6-8]、小鼠[10]和豚鼠[11]的哮喘均具有一定的防治作用。哮喘是目前最普遍的和发病率上升最快的疾病之一，临床表现为反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，伴有哮鸣音等[12]，严重影响患者生命质量，给家庭和社会带来巨大的思想和经济负担，己成为严重威胁公众健康的一种主要慢性疾病。哮喘发病急，急需能够快速发挥药效的药物进行急救。滴丸可以发挥速效作用，且制备工艺简单，容易携带。因此本研究将芍药甘草汤结合现代制剂技术制备成SGDP，以快速发挥其解痉、止痛、抗炎、镇咳等多种作用，达到快速缓解甚至治疗哮喘的目的，并对其质量进行控制，包括外观、重量差异、溶散时限和主要成分芍药苷、甘草酸、甘草苷的含量测定。

1 材料

炙甘草（北京盛世龙药业有限公司，批号：1706020），白芍（北京本草方源药业有限公司，批号：20160818），PEG4000（中国医药公司北京采购供应站营销，批号：900906），PEG6000（天津化学试剂六厂分厂，批号：20000708），蒸馏水，甲基硅油（市购），HP-20树脂（Solarbio公司，批号：707B021），芍药苷购置于中国药品检定研究院（批号：110736-201438），甘草苷购置于中国药品生物制品检定研（批号：110736-201438），甘草酸铵盐购置于SIGMA公司（Lot# BCBL1535V），分析纯乙醇，蒸馏水，ThermoFisher色谱乙腈和色谱三氟乙酸（TFA）购置于国药科兴化工产品（北京）有限公司，娃哈哈纯净水。真空旋转蒸发仪（Buchi R-210，Switzerland），滴丸机（TDSJ-A型，北京正大绿洲制药有限公司），万分之一和十万分之一电子分析天平（satorius公司），智能崩解仪（ZB-1E型，天大天发公司），Agilent HPLC仪（Aglient Techonologies 1200 series）。

2 方法与结果

2.1 芍药甘草总提物的制备及纯化-水提醇沉法 按《伤寒论》处方比例取白芍和炙甘草各240 g（1∶ 1），参考文献报道[13]，加10倍量的水浸泡0.5 h，煎煮1.5 h，过滤;药渣加入8倍量水煎煮1 h，过滤，合并2次滤液。加热浓缩至250 mL，即2 g（原药材）/mL左右，待放凉后加入（慢加快搅）乙醇使乙醇的体积分数达到75%，搅拌，4 ℃冰箱静置24 h，过滤，得滤液，使用真空旋转蒸发仪除去乙醇并浓缩滤液至30 mL。

2.2 HP-20大孔树脂继续纯化 树脂的预处理方法：用乙醇浸泡过夜，湿法装柱，柱体积约为500 mL，依次使用3倍量无水乙醇、95%乙醇、50%乙醇和10倍量左右蒸馏水洗脱。洗脱：将水提醇沉后的浓缩液，上样HP-20树脂柱，依次用10倍量水、3倍量50%和3倍量100%乙醇洗脱。收集50%和100%乙醇洗脱液，减压浓缩至重量为20.02 g，取10.01 g浓缩液用于制备滴丸。

2.3 SGDP的制备 参考文献[14]和实验摸索，选择PEG4000：PEG6000（1∶ 5）作为基质，甲基硅油作为冷却剂，制备滴丸。称取PEG4000和PEG6000分别为3.33 g、16.67 g，将基质于水浴上加热（85～90°C）熔融，加入上述纯化后的浓缩液10.01 g，搅拌混匀，保温下倾入滴丸器中，滴距4 cm，滴管口内径/外径为2 mm/2.8 mm，以适宜的滴速滴入互不相溶的冷却剂甲基硅油中，冷却剂温度15 ℃，冷却柱长度110 cm，冷却固化成丸，取出，除去冷却剂，即得SGDP。同法制备空白滴丸。

2.4 质量检测 1）外观性状：SGDP外观为棕褐色，表而光滑，色泽均匀，质地坚硬，味微苦，甘。2）重量差异：按照《中华人民共和国药典》2015版第四部通则0108丸剂质量检查法进行检查。3）溶散时限：按照《中华人民共和国药典》2015版第四部通则0921崩解时限检查法进行检查。

2.5 色谱条件 色谱柱：Kromasil 100-5 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm）;流动相：0.05%三氟乙酸水溶液（A）-0.05%三氟乙酸乙腈（B）;流速1.0 mL/min;检测波长芍药苷230 nm，甘草苷276 nm，甘草酸250 nm;柱温室温;进样量10 μL。流动相梯度见表1。

2.6 芍药苷、甘草苷、甘草酸铵盐混合对照品溶液的配置 用十万分之一天平精密称取芍药苷0.00240 g、甘草苷0.00209 g、甘草酸铵盐0.00210 g，分别溶于500 μL的甲醇、甲醇、50%甲醇，配置成10 mmol/L的芍药苷、甘草苷储备液，5 mmol/L的甘草酸铵盐储备液备用。分别取3种贮备液适量用70%的甲醇稀释， 制成含芍药苷、甘草苷、甘草酸铵盐的系列混合对照品溶液。各对照品溶液浓度见表2。

2.7 供试品溶液的制备 取本品20粒，研碎，精密称取0.0500 g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇8 mL，超声处理30 min，滤过，滤液置10 mL容量瓶中。用少量甲醇分次洗涤容器和残渣，洗液加入同一容量瓶中，70%甲醇定容至刻度，摇匀。取1 mL用0.45 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。空白滴丸按照同法提取，制备。

2.8 专属性实验 以SGDP的供试品溶液和空白滴丸的提取液进样，考察空白基质对芍药苷、甘草苷、甘草酸铵的测定是否有干扰。结果表明，按选取的色谱条件，供试品溶液中的杂质对芍药苷、甘草苷、甘草酸铵盐的测定均无干扰，如图1。

2.9 线性关系考察 精密吸取对照品溶液10 μL进样，以芍药苷、甘草苷、甘草酸铵盐的峰面积为纵坐标（Y），对浓度为横坐标（X），采用多元回归运算，得芍药苷、甘草苷、甘草酸銨盐的回归方程分别为y=6.856 8x-21.958（R2=0.999 5），y=7.082 9x-44.853（R2=0.997 8），y=2.937 2x+44.074（R2=0.992 7）。结果显示，芍药苷在100～600 μmol/L、甘草苷在60～160 μmol/L、甘草酸铵盐在20～120 μmol/L范围内线性关系均良好。

2.10 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，依法测定样品中芍药苷、甘草苷、甘草酸铵盐的峰面积，计算其 RSD 值分别为0.07%、0.04%、0.38%，说明精密度良好。

2.11 重复性考察 取同一批次的6份SGDP，分别按照供试品溶液的制备方法制备，测定芍药苷、甘草苷、甘草酸铵盐的峰面积。结果芍药苷、甘草苷、甘草酸铵盐的峰面积的 RSD 值（ n =6）分别为0.14%、0.29%、0.60%，说明重复性良好。

2.12 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，每隔1 h进样1次，考察8 h，测定芍药苷、甘草苷、甘草酸铵盐的峰面积。计算其 RSD 值分别为0.31%、0.11%和0.88%，保留时间极差分别为0.004 min、0.030 min和0.002 min，说明供试品溶液8 h内稳定性良好。

2.13 加样回收率试验 精密称取同一批SGDP样品约0.0250 g，平行6份，分别精密加入相当于0.0500 g样品中成分50%量的对照品（含约170.74 μmol/L即0.00082 g芍药苷，55.43 μmol/L即0.00023 g甘草苷，52.26 μmol/L即0.00044 g甘草酸铵盐），按供试品溶液制备法制备。照上述色谱条件测定，并分别记录其峰面积并代入标准曲线计算其浓度，以测定量（测得总量-样品中的量）与加入量的比值计算回收率，结果见表3～表5，说明加样回收率符合分析要求。

2.14 结果

2.14.1 质量差异 取供试品20丸，精密称定总质量，求得平均丸重后，再分别精密称定每丸的质量。20粒SGDP与平均每粒滴丸质量（0.0254 g）比较，其质量差异均小于药典规定限度15%，符合中华人民共和国药典规定。见表6。

2.14.2 溶散时限 6粒SGD P 均在5 min内溶散完全，溶散时限小于30 min，符合药典规定。

2.14.3 SGDP中芍药苷、甘草酸、甘草苷的含量   取不同批次的6份SGDP，分别按照供试品溶液制备方法制备，按照上述色谱条件测定。见表7。滴丸中，芍药苷的含量为（32.66±0.46）mg/g， RSD 为1.4%;甘草苷的含量为（9.23±0.23）mg/g， RSD 为2.5%;甘草酸铵盐的含量为（17.48±0.86）mg/g， RSD 为4.9%。各批次 RSD 均小于5%，说明工艺稳定、可行。

3 讨论

本研究中，SGDP的制备处方源自经典《伤寒论》的芍药甘草汤处方（白芍：炙甘草=1∶ 1）。由于滴丸的载药量相对比较小，因此，需对芍药甘草水煎提取物的浓缩液进行纯化。本研究首先选用水提醇沉对粗提物进行纯化，除去大部分蛋白质等水溶性强的杂质。然后选用HP-20大孔树脂进行进一步的纯化，收集50%和100%乙醇的洗脱液，减压除去溶剂，浓缩到稠膏状，经实验，与基质PEG4000-PEG6000（1∶ 5）1∶ 2的比例进行混熔，使用滴制法制备SGDP。在制备滴丸时，发现PEG4000：PEG6000=1∶ 5的基质与浓缩液1∶ 1混合后并不能形成圆整的滴丸，故适时调整为基质与药液的比例为2∶ 1，成型性好。

本研究按照《中华人民共和国药典》2015年版收录的滴丸的质量检查方法，对SGDP的重量差异和溶散时限进行检查，结果显示均合格。本研究还采用HPLC法首次同时测定了SGDP中的3种解痉、抗炎、抗哮喘[15-16]成分，即主要成分芍药苷、甘草苷、甘草酸的含量，方法简便、灵敏度高，重现性好、精密度高、加样回收率好，结果精确、可靠，为SGDP的质量控制提供了重要参考。

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