RFRP-3对大鼠附睾生殖功能的影响

李鸣 石博妹 张鑫 等

摘要：【目的】探究RFRP-3对大鼠附睾生殖功能的影响，为全面了解RFRP-3调控雄性动物的生殖生理功能提供理论依据。【方法】通过半定量RT-PCR检测不同发育阶段（20、40、60和80日龄）SD大鼠附睾中RFRP-3及其受体GPR147的表达情况;选取60日龄雄性SD大鼠，分别对其睾丸注射0（CK）、0.1、1.0和10.0 μg/d的RFRP-3，連续注射7 d，然后通过组织石蜡切片、酶活性测定、Western blotting等分别检测不同剂量RFRP-3对SD大鼠附睾形态学、Caspase-3活性、凋亡相关蛋白（Caspase-3和Bcl-2）和自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3和Atg5）表达的影响。【结果】RFRP-3和GPR147在不同发育阶段SD大鼠附睾中的表达水平呈波动性变化，均以60日龄的表达水平最高;不同剂量的RFRP-3均能导致SD大鼠附睾上皮细胞发生异常，使精子数量减少。与CK相比，不同剂量的RFRP-3均能极显著增加SD大鼠附睾Caspase-3活性（P<0.01，下同），还能显著（P<0.05，下同）或极显著提高附睾中活化Caspase-3与完整Caspase-3的比值，有效抑制Bcl-2的表达，且呈明显的剂量依赖关系。RFRP-3对SD大鼠附睾内自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-II/LC3-I和Atg5的表达出现相互矛盾的结果。【结论】RFRP-3在雄性大鼠附睾中有表达，但对附睾活性有直接抑制作用，具体作用原理是RFRP-3能诱导附睾中总Caspase-3裂解为活性Caspase-3并下调Bcl-2表达以触发附睾细胞凋亡，而附睾细胞的凋亡促使附睾退化及精子数量减少。

关键词： 大鼠;RFRP-3;附睾;生殖功能;凋亡相关蛋白;自噬相关蛋白

中图分类号： S865.12                         文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0405-07

Abstract：【Objective】 In order to provide theoretical basis for a comprehensive understanding of RFRP - 3 contro-lling on reproductive physiology function of the male animals， the study analyzed the effect of RFRP-3 on reproductive function of rats epididymis. 【Method】Semi-quantitative RT-PCR was used to study the expression of RFRP-3 and its receptor GPR147 in epididymis of different day-age（20， 40， 60 and 80 day-age） SD rats. 60 day-age male SD rats were selected and testis injection of 0（CK）， 0.1， 1.0， and 10.0 μg/d RFRP-3 were conducted on them respectively for continuous 7 d. Tissue paraffin section， enzyme activity detection and Western blotting were used to measure the epididymis morphology， Caspase-3 activity and the expression of apoptosis-related protein（Caspase-3 and Bcl-2） and autophagy-related protein（Beclin-1， LC3， Atg5） of epididymis injected with different doses of RFRP-3. 【Result】The result of Semi-quantitative RT-PCR suggested that RFRP-3 and GPR147 expressed in a fluctuating way during different development stages and had the highest expression level at 60-day-old in rat epididymis.  Different doses of RFRP-3 could all induce rat epididymal cell  abnormalities and reduce sperm counts. Compared with CK， the activities of Caspase-3 in epididymis injected with different doses of RFRP-3 were extremely increased（P<0.01， the same below）. Different doses of RFRP-3 could significantly（P<0.05， the same below） or extremely increase the ratio of cleaved Caspase-3/whole-Caspase-3，  inhibit the expression of Bcl-2 protein， and presented obvious dose-dependent feature. RFRP-3 provided conflicting results on expression of autophagy marker proteins Beclin-1， LC3-II/LC3-I and Atg5 in rat epididymis. 【Conclusion】RFRP-3 expresses in male rat epididymis，but inhibit its activity directly. RFRP-3 can promote the decomposition of whole-Caspase-3 into activated-Caspase-3 and downregulate the expression of Bcl-2 protein. RFRP-3 induces epididymis apoptosis， and then leads to epididymis degradation and sperm count decrease.

Key words： rat; RFRP-3; epididymis; reproductive function; apoptosis-associated protein; autophagy-associated protein

0 引言

【研究意义】促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）是日本Tsutsui团队在鹌鹑脑内发现的一种C端具有RF酰胺结构的新型神经肽，能抑制垂体促性腺激素释放（Tsutsui et al.，2000）。此后，在哺乳动物上也发现具有RF酰胺结构的神经肽，并将这种RF酰胺肽命名为RF相关肽（RFRP），其中RFRP-3与鸟类的GnIH生理作用一致，二者同源，G蛋白偶联受体147（G-protein coupled receptor 147，GPR147）为RFRP-3的特异受体（Hinuma et al.，2000;Ubuka et al.，2012）。因此，从附睾水平探索RFRP-3对雄性动物生殖功能的影响，可为研究RFRP-3调控动物的生殖生理功能提供理论依据。【前人研究进展】RFRP-3是目前在下丘脑中发现的唯一HPG轴抑制因子，在哺乳动物中RFRP-3神经元主要分布在下丘脑背内侧核，通过抑制促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）活性及黃体生成素（Luteinizing hormone，LH）释放，进而调控动物机体的生殖功能和性行为（Anderson et al.，2009;Ducret et al.，2009;Wu et al.，2009）。在雄性动物中，RFRP-3及其受体在猪、猕猴和叙利亚仓鼠睾丸中的表达量较高，在精原细胞、精母细胞、生精小管、支持细胞和间质细胞中也有分布，与精子的形成密切相关（Hinuma et al.，2000;龚金秋等，2017）。发情期雌性小鼠和猪的卵巢颗粒细胞及黄体细胞中也有RFRP-3表达，提示RFRP-3与卵泡发育有关（Li et al.，2013）。附睾是雄性生殖系统中的重要器官，哺乳动物的精子需在附睾中经历一系列复杂的结构与功能变化才能成熟并具有潜在受精能力（Martin-DeLeon，2015;Sullivan，2015;肖娟等，2018）。【本研究切入点】至今，鲜见RFRP-3与雄性动物附睾中细胞凋亡及自噬关系的研究报道。【拟解决的关键问题】通过检测不同发育阶段大鼠附睾中RFRP-3和GPR147 mRNAs的表达情况，然后通过体内试验检测不同剂量RFRP-3对大鼠附睾形态学、凋亡和自噬相关蛋白表达的影响，探究RFRP-3对大鼠附睾生殖功能的影响，为全面了解RFRP-3调控雄性动物的生殖生理功能提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

从广西医科大学实验动物中心购买两对刚性成熟的SPF级SD大鼠作为亲本，在恒温（22 ℃）干净的条件下进行饲养繁殖。RNA反转录试剂盒、Gol-den View核酸染料、DL2000 DNA Marker购自Vazyme公司，琼脂糖凝胶购自南京生兴生物技术有限公司，二甲苯、伊红染液和苏木素染液均购自Solarbio公司，蛋白Marker购自Thermo公司，BSA购自Sigma公司，Caspase-3活性检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，β-actin、Caspase-3、Bcl-2、Beclin-1、LC3和Atg5一抗和二抗均购自Cell Signaling Technology公司。RFRP-3、GAPDH和GPR147引物均由深圳华大基因股份有限公司合成。

1. 2 半定量RT-PCR扩增

分别选取20、40、60和80日龄的SD大鼠子代作为试验动物，每组6只。将大鼠处死后摘取双侧附睾，按照TRIzol说明提取总RNA，然后反转录合成cDNA。以GAPDH为内参基因，检测不同日龄SD大鼠附睾中RFRP-3和GPR-147 mRNA的表达水平。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，进行适当循环（表1）;最后72 ℃延伸10 min。取10.0 µL扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。半定量RT-PCR引物及反应条件如表1所示。

1. 3 附睾石蜡组织切片制作

选取24只60日龄雄性SD大鼠，体重350±10 g/只，随机均分为4组，对SD大鼠睾丸进行RFRP-3注射，注射剂量分别为0（CK）、0.1、1.0和10.0 μg/d，连续注射7 d。试验第8 d处死SD大鼠并剖解摘除附睾，将一侧附睾固定在中性福尔马林中（另一侧冻存用于后续试验），固定后进行常规脱水、透明、包埋和切片（厚度约5 μm）。经HE染色后，将切片置于光学显微镜下观察附睾中各种类型细胞的形态和数量，每个样品制作5个切片，每个切片取2个视野在400倍镜下进行观察。

1. 4 Caspase-3活性测定

取注射不同剂量RFRP-3的附睾样品约50 μg，按Caspase-3活性检测试剂盒说明，用酶标仪（λ=405 nm）测定各组样品的吸光度，通过计算OD试验/ODCK的倍数确定Caspase-3活性，每组重复6次。

1. 5 凋亡和自噬相关蛋白Western blotting检测

解冻不同剂量组的SD大鼠附睾组织样品。取约100 μg样品置于1.5 mL的EP管中，加入1.0 mL RIPA裂解液后匀浆裂解;裂解后4 ℃下12000 r/min离心5 min，收集沉淀;取2.0 μL蛋白样品用分光光度计测量其浓度，其余蛋白样品按1%比例加入FMSF后分装，-80 ℃保存备用。各剂量组取40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，经转膜、丽春红染色、脱脂牛奶封闭后，分别孵育一抗（活化Caspase-3、完整Caspase-3、Bcl-2、Beclin-1、Atg-5和LC3抗体，稀释比均为1∶1000）和二抗（辣根过氧化酶标记的抗羊或抗小鼠IgG，稀释比1∶10000），加入ECL化学发光液，按时曝光，扫描胶片进行灰度分析。每组重复6次。

1. 6 统计分析

试验数据采用SPSS 17.0进行统计分析，包括单因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD检验。

2 结果与分析

2. 1 RFRP-3和GPR147在不同日龄SD大鼠附睾中的表达情况

如图1所示， 20、40和80日龄SD大鼠附睾内的RFRP-3 mRNA表达水平无显著差异（P>0.05，下同）， 60日龄SD大鼠附睾内的RFRP-3 mRNA表达水平最高且极显著高于其他日龄（P<0.01，下同）。GPR147在不同日龄SD大鼠附睾中的表达情况与RFRP-3一致，也表现为60日龄的mRNA表达水平最高，且极显著高于20、40和80日龄，而20、40和80日龄间无显著差异。

2. 2 RFRP-3对SD大鼠附睾组织形态的影响

与CK（图2-A和图2-B）相比，经0.1和1.0 µg/d RFRP-3处理后SD大鼠附睾上皮细胞发生变性，甚至出现空泡化，附睾管内精子数量减少（图2-C、图2-D、图2-E和图2-F）;经10.0 µg/d剂量处理后SD大鼠附睾出现不完整的柱状上皮，附睾管内精子数量明显减少（图2-G和图2-H）。此外，经不同剂量的RFRP-3处理后均能引起SD大鼠附睾内腔中多核巨细胞剥脱且呈明显的剂量依赖关系。

2. 3 RFRP-3對SD大鼠附睾Caspase-3活性的影响

与CK相比，不同剂量的RFRP-3均能极显著增加SD大鼠附睾Caspase-3活性，且Caspase-3活性的增加呈剂量依赖关系（图3）。

2. 4 RFRP-3对SD大鼠附睾凋亡相关蛋白表达的影响

Western blotting检测结果显示，以完整Caspase-3、活化Caspase-3、Bcl-2和β-actin为一抗时，分别在36、17、26和45 kD附近出现明显的条带（图4-A）。经0.1和1.0 μg/d RFRP-3处理后SD大鼠附睾中活化Caspase-3与完整Caspase-3的比值显著高于CK处理（P<0.05，下同），而经10.0 μg/d RFRP-3处理后其比值极显著高于CK处理（图4-B），说明RFRP-3能有效提高SD大鼠附睾Caspase-3活性，且呈明显的剂量依赖关系。此外，与CK相比，经0.1和1.0 μg/d RFRP-3处理后SD大鼠附睾中Bcl-2的相对表达量均显著降低，而经10.0 μg/d RFRP-3处理后Bcl-2的相对表达量极显著降低（图4-C），说明RFRP-3能有效抑制SD大鼠附睾中Bcl-2的表达，且这种抑制作用呈剂量依赖关系。

2. 5 RFRP-3对大鼠附睾自噬相关蛋白表达的影响

Western blotting结果显示，以Beclin-1和Atg5为一抗时，分别在60和55 kD附近显示出单一条带;而以LC3为一抗时在14和16 kD附近出现2条免疫反应条带（图5-A）。与CK相比，经0.1 μg/d RFRP-3处理后SD大鼠附睾中Beclin-1的相对表达量极显著降低，1.0 μg/d剂量组的相对表达量显著降低，但经10.0 μg/d RFRP-3处理后其相对表达量极显著升高（图5-B），即RFRP-3对SD大鼠附睾中Beclin-1的表达呈低浓度抑制高浓度促进作用。RFRP-3对SD大鼠附睾中Atg5的表达也表现出低浓度抑制高浓度促进作用，经0.1 μg/d RFRP-3处理后Atg5的相对表达量较CK极显著降低，而在1.0 μg/d剂量组中的相对表达量显著增加，10.0 μg/d剂量组中的相对表达量极显著增加（图5-C）。此外，与CK相比，经1.0和10.0 μg/d RFRP-3处理后SD大鼠附睾中LC3-II/LC3-I显著升高（图5-D），说明一定浓度的RFRP-3能有效提高SD大鼠附睾LC3活性。

3 讨论

至今，有关GnIH/RFRP-3的研究主要集中于其表达分布。Hinuma等（2000）研究发现，在大鼠的下丘脑、眼及睾丸组织中均有RFRP-3 mRNA表达;Zhang等（2010）研究发现在斑马鱼的中枢神经系统、眼、卵巢和睾丸组织中均有GnIH mRNA表达。本研究也证实，RFRP-3和GPR147在不同日龄的SD大鼠附睾中均有表达。可见，GnIH/RFRP-3不仅分布在动物的中枢系统，在其外周组织同样存在广泛分布。此外，有研究表明RFRP-3和GPR147的表达情况在睾丸不同发育阶段呈波动变化（Ubuka et al.，2006;Zhao et al.，2010;Anjum et al.，2014）;本研究结果也显示60日龄SD大鼠附睾中RFRP-3和GPR147的表达水平最高，与雄性大鼠的性成熟和精子成熟期基本吻合，故推测RFRP-3在大鼠附睾精子成熟过程中发挥重要作用。

GnIH/RFRP-3可直接作用于性腺，且与动物性腺组织形态学的变化有密切关系。Ubuka等（2006）通过渗透泵将GnIH持续作用于性成熟的雄性鹌鹑，2周后发现GnIH呈剂量依赖性地抑制血清中的LH和睾酮分泌，同时诱导雄性鹌鹑睾丸生殖细胞凋亡，在形态学上缩小了生精小管直径，抑制精子产生。Singh和Krishna（2010）在小鼠中也获得类似的研究结论，即RFRP-3能增加异常窦腔卵泡的数量，但减少卵巢中黄体的数量。由于RFRP-3和GPR147 mRNA在大鼠附睾中均有表达，故推测RFRP-3可直接作用于大鼠附睾。根据本研究的石蜡切片观察结果可知，不同剂量组中RFRP-3均可导致SD大鼠附睾管中的精子数量减少，与GnIH在雄性鹌鹑上的作用效果（Ubuka et al.，2006）一致，但精子数量减少的具体机理有待进一步探究。其次，经RFRP-3处理后的SD大鼠附睾在组织形态上也发生病理变化，表现为0.1和1.0 µg/d剂量组SD大鼠附睾上皮细胞发生变性，甚至出现空泡化，10.0 µg/d剂量组的附睾出现不完整的柱状上皮。此外，有研究表明RFRP-3能导致雄性小鼠生殖细胞增殖和存活标记物减少，且睾丸中凋亡标志物的产生增加（Anjum et al.，2014）。说明RFRP-3促使大鼠附睾退化及精子数量减少是通过诱导附睾细胞凋亡来实现，即RFRP-3对附睾活性具有直接的抑制作用。

本研究结果表明，RFRP-3能有效提高SD大鼠附睾Caspase-3活性，且呈明显的剂量依赖关系，提示RFRP-3呈剂量依赖性地上调大鼠附睾细胞的凋亡水平。Caspase-3和Bcl-2的表达呈剂量依赖性下降趋势，而活性Caspase-3的表达随剂量的增加而增加，说明RFRP-3能诱导附睾中的Caspase-3裂解为活性Caspase-3并下调Bcl-2以触发附睾细胞凋亡。这与Ubuka等（2006）、Anjum等（2014）的研究结果一致，表明RFRP-3导致雄性哺乳动物中的性腺和副生殖器退化与睾丸和附睾细胞凋亡有关。细胞凋亡和自噬间相互干扰控制，共同决定着细胞的命运。自噬的功能作用一方面可通过增强Caspase-3活性而加速细胞凋亡，另一方面又能延迟Caspase-3活化作为细胞延长生命的机制（Nikoletopoulou et al.，2013;Kasprowska-Liśkiewicz，2017）。本研究结果显示，在10.0 μg/d剂量组中RFRP-3处理引起SD大鼠附睾中LC3-II/LC3-I显著升高且附睾中Beclin-1和Atg5的表达增加，而在0.1 μg/d剂量组中Beclin-1和Atg5的表达呈下调趋势，提示不同剂量RFRP-3引起附睾自噬标志蛋白表达出现相互矛盾的结果。因此，推测RFRP-3诱导的自噬可增强或抵抗细胞凋亡。

4 結论

RFRP-3在雄性大鼠附睾中有表达，但对附睾活性有直接抑制作用，具体作用原理是RFRP-3能诱导附睾中的Caspase-3裂解为活性Caspase-3并下调Bcl-2表达以触发附睾细胞凋亡，而附睾细胞的凋亡促使附睾退化及精子数量减少。

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（責任编辑 兰宗宝）