木薯AGPase基因家族的生物信息学及其表达分析

王明 肖鑫辉 应东山 等

摘要：【目的】搜索鉴定木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）的基因家族成员，并分析其生物学信息及不同组织和非生物胁迫下的表达情况，为木薯AGPase基因的功能挖掘及淀粉性状遗传改良提供理论依据。【方法】从木薯基因组数据库（Phytozome）下载木薯全基因组序列，从中筛选含NTP_transferase（Pfam编号PF00483）保守结构域序列的AGPase基因家族成员，利用生物信息学方法对其结构特征及编码蛋白序列进行分析。基于NCBI转录组测序（RNA-seq）数据，对木薯AGPase基因家族成员在不同组织及冷害和干旱胁迫下的表达模式进行分析。【结果】从木薯全基因组序列中共鉴定出9個AGPase基因家族成员，包含6个AGPase大亚基（LS）基因和3个小亚基（SS）基因。6个LS基因在长度和编码氨基酸数目上差异明显，但3个SS基因间的差异不明显。LS基因外显子数目为8～15个，SS基因外显子数目均为9个。9个木薯AGPase基因家族成员分布于8条染色体和1个scalefold中，未在染色体上发现串联成簇分布现象。木薯AGPase基因家族启动子区域含有多个干旱响应元件、光响应元件、激素响应元件及多种除干旱外的其他非生物胁迫响应元件。9个AGPase基因家族成员在不同木薯组织间的表达模式具有组织特异性。经冷害胁迫后，除MeAGL1.3基因外，其余8个基因表达量均极显著（P<0.01，下同）或显著（P<0.05，下同）下调;经干旱胁迫后，MeAGL1.4、MeAGS1.1、MeAGS1.2和MeAGS2基因表达量极显著或显著下调，MeAGL1.3基因的表达量显著上调，其余基因与对照无显著差异（P>0.05）。【结论】木薯AGPase基因家族成员具有保守的基因结构和功能结构域，其表达具有组织特异性，大多数成员表达水平受冷害和干旱胁迫调控。

关键词： 木薯;腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（AGPase）;生物信息学;组织;干旱;冷害;表达分析

中图分类号： S533.035.3                      文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0222-08

Abstract：【Objective】Gene family members of ADP-glucose pyrophosphorylase（AGPase） in cassava were identified， their bioinformatics and expression in different tissues and under various abiotic stresses were analyzed. This would provide reference for mining functions of gene AGPase and genetic improvement of starch characters. 【Method】Cassava whole genome sequences were downloaded from cassava genome data（Phytozome）. The AGPase gene family members with NTP_transferase（Pfam number PF00483） conserved domain sequence were selected， then their structure characters and the encoded protein sequence were analyzed by bioinformatics. Based on data of NCBI transcriptome sequencing（RNA-seq）， the expression patters of cassava AGPase gene family members in different tissues， chilling stress and drought stress were studied. 【Result】Nine AGPase gene family members were identified from cassava whole genome sequence， including six large subunit（LS） genes and three small subunit（SS） genes. The difference in length and encoded amino acid amount among the six LS genes was large， but the difference among the three SS genes was small. LS genes contained eight-fifteen extrons， all of SS genes contained nine extrons. The cassave AGPase genes were distributed in eight chromosomes and one scalefold，and no cluster distribution was found on chromosomes. Moreover， the promoter regions of AGPase genes usually harbored drought-，light-，hormone- and other abiotic stresses-responsive elements in cassava， and the nine AGPase genes were tissue-specific expressed in cassava. Furthermore， except for MeAGL1.3 gene，the other eight genes were extremely（P<0.01， the same below） or significantly（P<0.05， the same below） down-regulated under chilling stress. Four genes MeAGL1.4， MeAGS1.1，MeAGS1.2 and MeAGS2 were extremely or significantly down-regulated and MeAGL1.3 up-regulated under drought stress condition. Other genes had no significant difference compared with control（P>0.05）. 【Conclusion】Cassava AGPase gene family members contain conserved gene structure and functional domain， their expressions are tissue-specific. Most of the members are regulated by chilling and drought stresses.

Key words： cassava; ADP-glucose pyrophosphorylase gene（AGPase）; bioinformatics;  tissue; drought; chilling; expression analysis

0 引言

【研究意义】木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界三大薯类作物之一，享有“淀粉之王”的美称，主要种植于热带及非洲和亚洲的亚热带地区，为全球粮食安全提供保障（Burns et al.，2010）。淀粉是植物儲藏碳水化合物和能量的主要形式，也是食品、饲料等加工领域中重要的原材料。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉生物合成途径中的第一个限速酶，通过转化葡萄糖1-磷酸（GLC-1-P）和ATP来限制催化反应。因此，利用生物信息学方法研究木薯AGPase基因家族，揭示其成员数量、理化特性、染色体分布、基因结构、进化关系和时空表达特征等，对木薯淀粉合成途径的遗传改良具有重要指导意义。【前人研究进展】植物体内淀粉的合成主要受腺苷二磷酸—葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和淀粉脱支酶（DBE）等关键酶基因控制（Tuncel and Okita，2013）。其中，AGPase活性与直链淀粉、支链淀粉和总淀粉的积累速率和灌架速率呈极显著正相关，是淀粉合成过程中的主要限速酶（周彩琴和王丽娟，2011）。抑制AGPase活性将直接抑制部分甚至全部淀粉的合成，如转基因小麦的AGPase基因过量表达时植株淀粉含量显著增加，但导入反义抑制的AGPase基因后淀粉合成量显著降低（Saripalli and Gupta，2015）。此外，非生物胁迫如高温和干旱也可抑制AGPase活性，从而导致作物产量显著降低（Saripalli and Gupta，2015）。AGPase蛋白为异源四聚体，由两个相似的小亚基（Small subunit，SS）和两个相似的大亚基（Large subunit，LS）组成，由不同的核基因编码，LS的分子量为54～60 kD，SS分子量为51～55 kD（Georgelis et al.，2007）。由于LS是酶活性的调节中心，而SS是酶活性的催化中心，故SS的氨基酸序列保守性较LS高（Georgelis et al.，2007）。目前，已从水稻、玉米、小麦和马铃薯中克隆获得多个AGPase基因（Shaw and Hannah，1992;Nakata et al.，1994;Thorneycroft et al.，2003;Rose et al.，2016）。近年来，随着木薯基因组测序的完成，为发掘木薯AGPase基因提供了便利条件（Bredeson et al.，2016）。【本研究切入点】目前，有关AGPase的研究主要集中于温带禾本科植物，而针对热带作物的研究较少，尤其是木薯AGPase的基因数目、染色体分布等相关研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】从木薯基因组数据库（Phytozome）中搜索木薯AGPase基因家族序列，利用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、基因结构和功能域等进行预测分析，为木薯AGPase功能基因的挖掘及性状遗传改良提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 木薯AGPase基因家族成员鉴定

从Phytozome数据库下载木薯全基因组序列。以NTP_transferase（Pfam编号PF00483）保守结构域的氨基酸序列为原始检索序列，利用BLASTP程序（1e-5）在木薯基因组序列中进行搜索，获得NTP_transferase的同源序列，并将其在Pfam和NCBI数据库中进一步比对验证，去除重复冗余序列，即为候选木薯AGPase基因家族成员，其蛋白质理化性质（分子量大小、等电点等）利用ExPASy ProtParam进行预测。

1. 2 木薯AGPase基因家族结构分析

利用Gene Structure Display Server绘制AGPase基因家族成员的外显子—内含子结构图，对其基因全长、编码区和非编码区长度及内含子和外显子数目进行分析。

1. 3 木薯AGPase保守结构域预测及染色体分布分析

采用MEME 4.11.1分析木薯AGPase保守结构域，基序最大数目设置为10，基序长度设为6～200个氨基酸（Bailey et al.，2006）。利用MG2C绘制染色体分布图。

1. 4 系统发育进化树构建

使用ClustalX 1.8对木薯、水稻、玉米、拟南芥、高粱和马铃薯AGPase蛋白质进行氨基酸序列比对。基于多序列比对结果，以MEGA 7.0采用邻接法（Neighbor-Joining）构建AGPase的系统发育进化树（Kumar et al.，2016）。

1. 5 木薯AGPase基因家族启动子分析

从Phytozome数据库中提取各木薯AGPase基因家族成员起始密码子上游2000 bp基因组序列，利用PlantCARE预测其顺式作用元件，并以TBtools绘制启动子顺式元件图形（Chen et al.，2018）。

1. 6 木薯AGPase基因家族表达模式分析

AGPase基因在11个木薯组织（易碎胚性愈伤组织、须根、侧芽、叶、中脉、体细胞起源的胚性组织、叶柄、根尖分生组织、茎尖分生组织、茎和储藏根）中的原始转录组数据来源于NCBI数据库（登录号PRJNA324539）（Wilson et al.，2017）。4 ℃冷害胁迫24 h和20% PEG-6000干旱胁迫6 h后AGPase基因的原始转录组数据均来源于NCBI数据库（登录号PRJNA377165）（Li et al.，2017）。首先，利用SRA Toolkit将测序数据sra文件转换为fastq文件，再利用Trimmomatic去除测序数据中的接头序列和低质量序列，使用FastQC对测序数据进行质量控制，最后，利用参转录组定量工具Kallisto计算FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）值，将其作为基因的表达量。利用R3.0.2绘制木薯AGPase基因家族成员表达热图。利用独立样本双尾 t 测验的统计方法，检验木薯冷害胁迫和干旱胁迫处理后AGPase基因FPKM的显著性。

2 结果与分析

2. 1 木薯AGPase基因家族的鉴定及蛋白特性分析结果

在木薯基因组检索获得的木薯NTP_transferase同源序列经比对验证、去除重复冗余后，共获得9个AGPase基因家族成员，分别为MeAGL1.1、MeAGL1.2、MeAGL1.3、MeAGL1.4、MeAGL2.1、MeAGL2.2、MeAGS1.1、MeAGS1.2和MeAGS2，其中6个为AGPase大亚基（LS）基因，3个为AGPase小亚基（SS）基因，具体信息见表1。6个LS基因长度差异明显，为2572～6359 bp，3个SS基因长度差异不明显，为3845～4928 bp。LS的氨基酸数目差异明显，为277～528个，蛋白质相对分子质量30.6～59.1 kD;SS的氨基酸数目差异不明显，为496～526个，蛋白质相对分子质量55.1～57.8 kD。LS等电点为5.12～9.01，SS等电点为6.07～7.97。从表2可知，LS蛋白变异较大，氨基酸序列同源性为12%～90%，SS蛋白变异较小，氨基酸序列同源性为44%～93%，MeAGL1.1与MeAGL1.2、 MeAGS1.1与MeAGS1.2的氨基酸序列同源性较高，均大于90%，MeAGL2.1与其余8个AGPase基因家族成员的同源性均较低。

2. 2 木薯AGPase基因家族的结构分析结果

由图1可知，9个木薯AGPase基因家族成员均含多个外显子，其中LS基因外显子变异幅度较大，其数目8～15个;SS基因外显子数目相同，均为9个，且各外显子长度相近。仅MeAGL1.2基因由内含子（Intron）和外显子（CDS）组成，其他基因均由外显子、非编码区（UTR）和内含子组成。

2. 3 木薯AGPase保守结构域预测及染色体分布分析结果

利用MEME 4.11.1分析木薯AGPase基因家族成员的motif，结果如图2所示。该基因家族成员含6个motif，其中，LS基因中MeAGL2.1含3个motif，MeAGL2.1含4个motif，其他4个LS基因均含6个motif;SS基因中MeAGS1.1和MeAGS1.2均含有6个motif，MeAGS2缺少motif 2。

染色体分布分析结果如图3所示。9个AGPase基因家族成员分布于8条染色体和1个scalefold中，未在染色体上发现串联成簇分布现象。

2. 4 系统发育进化树构建结果

基于AGPase蛋白氨基酸序列同源性构建系统发育进化树，如图4所示。AGPase蛋白可分为两大类：LS类和SS类。其中，LS类又可分为4个亚类，第一亚类为双子叶AGPase蛋白，包括MeAGL2.1、MeAGL2.2、MeAGL1.3、马铃薯（Solanum tuberosum）StAGL P5-5242、拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtAGL P55230、AtAGL Q9SIK1和AtAGL P55230;第二亚类为单子叶AGPase蛋白，包括玉米（Zea mays）ZmAGL B6TCZ8、ZmAGL P55241、水稻（Oryza sativa）OsAGL Q688T8、OsAGL Q7G066和高粱[Sorghum bico-lor（L.） Moench]SbAGL O48877;第三亚类包括3个LS基因，即MeAGL1.4、ZmAGL A7LB43和OsAGL Q0D713;第四亚类包括MeAGL1.1、MeAGL1.2、ZmAGL A5GZ73、OsAGL Q6AVT2、StAGL P55243和AtAGL P55229。AGPase小亚基可分为3个亚类，第一亚类包括MeAGS2和AtAGS F4I8U2;第二亚类包括MeAGS1.1、MeAGS1.2、AtAGS P55228和StAGS P23509;第三亚类包括ZmAGS Q941P2、ZmAGS Q947C0、ZmAGS Q947B9、OsAGS Q96T99和OsAGS P15280。

2. 5 木薯AGPase基因家族的启动子分析结果

木薯AGPase基因家族启动子顺式作用元件分析结果（图5）表明，所有启动子区域均含多个干旱响应元件（MBS）和光响应元件（Light responsive element），且至少含有两种激素响应元件，如茉莉酸响应元件（MeJA responsive element）、脱落酸响应元件（Abscisic acid responsive element）、生长素响应元件（Auxin responsive element）、水楊酸响应元件（Salicylic acid responsive element）和赤霉素响应元件（GARE）等。此外，木薯AGPase基因家族启动子区域还包含多种其他非生物胁迫响应元件，如渗透压胁迫应答元件（STRE）、低温应答元件（LTR）和伤害应答元件（WUN-motif）。

2. 6 木薯AGPase基因家族的组织表达谱分析结果

对11个木薯组织AGPase基因家族成员的转录组数据进行分析，并利用Heatmap构建表达热图（图6），结果显示，9个AGPase基因家族成员在不同木薯组织间的表达模式各不相同。其中，MeAGL1.1和MeAGL1.2基因在叶中的表达量最高，其次是中脉，在其他组织中的表达量较低或不表达;MeAGL1.3基因仅在储藏根中有较高的表达量，暗示该基因为根特异性表达基因。MeAGL1.4、MeAGL2.1和MeAGL2.2基因的表达模式非常相近，除MeAGL1.4基因在体细胞起源的胚性组织中表达量稍高外，在其他组织中的表达量均不高，尤其在储藏根、须根、茎和叶柄中表达量非常低。MeAGS1.1、MeAGS1.2和MeAGS2基因的表达模式也非常相近，三者均在须根、茎尖分生组织、侧芽、易碎胚性愈伤组织和体细胞起源的胚性组织中的表达量极低，在叶柄和中脉中的表达量稍高，但在其他组织中这3个基因的表达量存在明显差异，如MeAGS1.1基因在储藏根和叶中的表达量高于MeAGS1.2和MeAGS2基因，MeAGS1.2基因在根尖分生组织中的表达量较高，MeAGS2则在茎中的表达量较高。

2. 7 木薯AGPase基因在冷害和干旱胁迫下表达分析结果

分别对冷害胁迫和干旱胁迫后木薯AGPase基因转录组数据进行分析，结果如图7和表3所示。根据表达模式的差异，9个AGPase基因可分为3组，第一组包括MeAGL1.2、MeAGS1.1、MeAGS1.2、MeAGL1.4和MeAGS2基因，经冷害和干旱胁迫后这5个基因的表达量均较对照（不作任何处理）下调。第二组仅包括MeAGL1.3基因，该基因的表达模式与其他基因不同，冷害胁迫后该基因的表达量与对照无显著差异（P>0.05，下同），而干旱胁迫后该基因表达量较对照极显著上调（P<0.01，下同），表明该基因可能参与干旱胁迫响应。第三组包括MeAGL1.1、MeAGL2.1和MeAGL2.2基因，三者表达模式相同，干旱胁迫后基因表达量与对照无显著差异，但冷害胁迫后3个基因表达量均较对照极显著或显著（P<0.05，下同）下调。整体来看，与对照相比，冷害胁迫后，除MeAGL1.3基因外，其余8个基因表达量均极显著或显著下调;干旱胁迫后，MeAGL1.4、MeAGS1.1、MeAGS1.2和MeAGS2基因表达量极显著或显著下调，MeAGL1.3基因的表达量显著上调，其余基因与对照无显著差异（表3）。

3 讨论

前人研究表明，拟南芥基因组含4个AGPase LS基因和2个AGPase SS基因，玉米基因组含5个AGPase LS基因和2个AGPase SS基因，水稻基因组含4个AGPase LS基因和2个AGPase SS基因，香蕉基因组含6个AGPase LS基因和2个AGPase SS基因（Jourda et al.，2016）。本研究利用NTP_transferase保守结构域序列在木薯基因组中进行BLASTp搜索，共发现9个AGPase基因家族成员，其中6个为LS基因、3个为SS基因;LS蛋白变异较大，氨基酸序列同源性为12%～90%，而SS变异较小，氨基酸序列同源性为44%～93%，与Saripalli和Gupta（2015）的研究结果相似。Saripalli和Gupta（2015）对拟南芥、水稻和番茄基因组的LS和SS蛋白氨基酸序列同源性进行比对分析，结果表明，SS在同一物种内的氨基酸序列同源性高于70%，而LS的氨基酸序列同源性仅为50%左右。可见，AGPase SS基因比LS基因具有更高的保守性，可能与SS是酶活性的催化中心相关，或进化过程中对SS进行更高的纯化选择（Georgelis et al.，2007）。

本研究木薯AGPase基因的结构分析结果表明，LS基因比SS基因具有更多的外显子。这与前人的研究结果（Batra et al.，2017）一致，Batra等（2017）分析了玉米、水稻和马铃薯等11种植物的AGPase基因的结构，结果发现，在单子叶植物中LS基因具有14～15个外显子，在双子叶植物中LS基因具有12～14个外显子，单子叶和双子叶植物中的SS基因均只有9～10个外显子。此外，本研究木薯LS与SS蛋白均含有NTP_transferase保守结构域序列，将其与水稻、玉米、拟南芥、高粱和马铃薯的AGPase蛋白序列构建系统发育进化树，这些AGPase基因可明显分为LS和SS两大类。其他物种如香蕉和小麦中，LS和SS基因也能明显区分，可能是LS基因和SS基因的进化速率差异较明显（Jourda et al.，2016）。

本研究发现，木薯AGPase基因家族启动子顺式作用元件中含多个光响应元件，可能与淀粉白天合成、黑夜降解的节律控制有关;同时，含至少2种植物生长激素响应元件，暗示AGPase基因与植物生长发育密切相关;另外，顺式作用元件中包含多种非生物胁迫响应元件，表明AGPase基因可能参与低温、干旱等抗胁迫相关调控。本研究转录组数据分析结果也显示，木薯AGPase基因在冷害胁迫和干旱胁迫下mRNA水平均显著升高或降低，表明这些基因参与冷害和干旱胁迫响应。已有研究表明，在非生物胁迫如高温和干旱条件下，小麦AGPase的LS基因和SS基因均下调表达，如小麦经37 ℃高温处理后，AGPase基因的表达水平急剧下降（Hurkman et al.，2003）。前人研究表明，植物AGPase基因在不同组织中均可表达，且表达量存在明显差异，如小麦AGPase的LS基因和SS基因在開花期和籽粒灌浆期胚乳中表达量较高，在营养组织（根和叶）中表达量较低（Burton et al.，2002）。本研究也发现，9个木薯AGPase基因家族成员在不同组织间的表达模式各不相同，其中，MeAGL1.1和MeAGL1.2基因在叶中表达量最高，MeAGS1.1基因在茎中表达量最高，MeAGL1.3基因则在储藏根中的表达量最高。已有研究表明，当扁豆从长日照进入短日照时，叶片中SS1基因上调表达，而LS1基因和SS2基因显著下调表达，推测叶和茎中不同AGPase基因的表达差异与植物体内碳源的流向有关（Seferoglu et al.，2013）。储藏根是木薯淀粉合成的重要场所，含有65%～91%的淀粉，其淀粉含量与木薯AGPase基因的表达密切相关，当AGPase基因的表达被反义抑制98.5%时，淀粉含量下降95%，但过量表达AGPase基因时，转基因木薯的淀粉含量可提高166%（Tappiban et al.，2019）。MeAGL1.3基因仅在储藏根中高效表达，推测该基因在储藏根的淀粉合成中发挥重要调控作用。在后续研究中，将以不同淀粉含量的木薯为试验材料，分析AGPase基因家族对淀粉的表型效应影响，挖掘引起淀粉变异的关键序列位点，并将其转化为功能标记，为分子标记辅助选择培育优良木薯品种提供理论依据。

4 结论

从木薯基因组中筛选出的9个AGPase基因家族成员具有保守的基因结构和功能结构域，其表达具有组织特异性，大多数成员表达水平受冷害和干旱协迫调控。

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（責任编辑 陈 燕）