猪单核源性巨噬细胞受FSL.1刺激后IncRNAs的鉴定与特征分析

赵为民　方晓敏　涂枫　周李生　李碧侠　王学敏　付言峰　任守文

摘要：lncRNA是新近发现的一种具有重要功能的RNA分子，在各种生理活动中发挥着重要作用。为鉴定猪单核源性巨噬细胞受FSL-1刺激后相关的lneRNA，利用二代测序技术结合生物信息学对lncRNA进行了组装与特征分析。结果显示FSL-1刺激成功地构建了细胞炎症模型，试验组与对照组共鉴定到l056个lncRNA转录本，其对应于831个基因座，这些lneRNA的平均长度为1643 bp，平均外显子数为2.4个。相对于对照组，试验组有51个IncRNA.上调表达，44个lncRNA下调表达。在上调lncRNA两侧相邻的蛋白质编码基因参与免疫反应、炎症反应、病毒反应等通路，而在下调lncRNA两侧相邻的蛋白质编码基因参与的通路较少，不参与上述通路。定量PCR结果显示挑选的4个lncRNA的差异倍数与RNA-Seq的结果相似，其中上调的IncRNA呈现一定的组织特异表达，而下调的lncRNA呈现多组织表达。这些结果为进一步研究IncRNA在FSL-1介导的炎症反应中的作用奠定了基础。

关键词：猪;IneRNA;单核源性巨噬细胞;FSL-1;炎症

中图分类号：S828

文献标识码：A

文章编号：1000-4440（2019）02-0346-11

长链非编码RNA（Long non-coding RNA，ln-cRNA）是一类不具有编码蛋白质能力而本身长度超过200 bp的RNA分子。基于其在基因组上相对于蛋白质编码基因的位置主要可分为3种：基因间长链非编码RNA（Long intervening non-coding RNA，lineRNA），自然反义链（Natural antisense transcript，NAT）和内含子长链非编码RNA（Intronic long non-coding RNA）。lncRNA 由于其较低的物种间保守性在最初大量发现时被认为是转录噪音，不具有生物学功能"。随着近年对lncRNA研究的不断深入，lncRNA受到越来越多的关注，其功能从最初参与的X染色失活[2]到后来的细胞亚小体生成[3]、细胞重编程[4]胚胎发育[5]、干细胞多能性[6]、肌与脂肪生成[7-8]、肿瘤癌症[9-10]等各种细胞生命活动中。

天然免疫系统是宿主抵御病原体入侵的第一道防线，其介导宿主的早期炎症反应对机体在抵抗病原体感染过程中发挥着关键作用”。然而炎症反应中炎症因子的紊乱表达会影响宿主对病原体感染的抵抗，研究结果表明，肺部炎症因子的紊乱表达与宿主对支原体肺炎的易感性密切相关[12-13]。炎症因子的释放由宿主PRRs与PAMP的识别以及细胞内复杂的信号转导等一系列事件构成[11]，越来越多的研究结果表明炎症因子的释放不仅受到一些经典的相关蛋白质基因和miRNA调控[11，14]，IncRNA在其中也发挥着重要的调控作用[15-16]，因而探索lncRNA在炎症反应中的作用对深入了解炎症因子的精确调控具有重要意义。

巨噬细胞作为宿主与外界病原体之间天然免疫反应的关键防线，其与病原体之间的互作情况对宿主的感染进程有重要的决定作用[17-20]。来源于外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PM-BC）在体外培养时通过添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）可形成单核源性巨噬细胞（Monocyte-derived macrophage，MDM）[21]。相对于屠宰猪获取的巨噬细胞，MDM的获取简单方便，因而可对不同品种、不同年龄阶段猪种进行持续稳定的研究。

本研究通过RNA-Seq结合生物信息学分析对猪单核源性巨噬细胞受支原体脂蛋白FSL-1刺激后的IneRNA进行鉴定与特征分析，为进一步研究IncRNA在FSL-1介导的炎症反应中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试剂

RNA提取试剂盒Direct-zolTM RNA Kits 购于Zymo research 公司，DNA marker、cDNA反转录试剂盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTM II定量试剂盒购于TaKa-Ra公司，DMEM培养基、0.25%胰酶、1640培养基、青链霉素、胎牛血清购于Thermofisher公司，猪外周血单个核细胞分离液KIT购于天津TBD公司，GM-CSF購于RD system公司，FSL-1购于InvivoGen公司。

1.2 猪单核巨噬细胞的培养及FSL-1刺激

猪来源于江苏省农业科学院六合动物科学基地，苏山猪种，采用猪外周血单个核细胞分离液KIT分离3头健康猪外周血单核细胞，全培养基（10%FBS+90%RPMI1640）中添加终质量浓度20ng/mlGM-CSF培养7d，每2.5d换1次液，得到猪单核源性巨噬细胞121-22，设置对照组与试验组，每组3个生物学重复。试验组加入终质量浓度100ng/ml的FSL-1，对照组加入相应的PBS，刺激6h后收集细胞提取RNA。

1.3 RNA测序的文库构建

RNA提取参照试剂盒说明书操作，并进行DNaseI处理，纯化及回收。DNaseI处理效果用PCR检测，引物见表1，Agilent 2100分析RNA的完整性，当RNA完整性相关参数RIN≥8，28S/l8S≥1.5时可进行测序文库的构建。RNA测序文库依据NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for llumina的说明操作，简单如下：提取总RNA先进行poly+A的纯化，然后进行eDNA第一链及第二链的合成，再对cDNA产物进行末端修复，3'末端加A和加A-dapter，最后进行连接产物的纯化回收，上样测序，产出原始数据Raw reads。

1.4 转录本的构建及lncRNA的鉴定流程

Rawreads经过去除Adapter、ploy-N以及低质量的Reads，得到Clean reads。然后通过HISAT2将Clean reads比对猪基因组Sserofa11.1，基于比对结果用StringTie组装转录本，从NCBI和Ensemble上分别下载猪的蛋白质编码基因的位置信息（染色体及其起始终止位置），版本分别为NCBI AnnotationRelease：106（猪的蛋白质编码基因以NM_和XM_开头）和Ensemble release 91（Protein_coding）。采用以下步骤来鉴定lncRNA：（1）过滤小于200bp长度以及表达量极低的转录本（FPKM<0.01）;（2）去除和NCBI以及Ensemble中猪蛋白质编码基因位置重叠的转录本;（3）去除Coding potential calculator（CPC）（231 tool>0的转录本;（4）去除NCBI blastX中有对应蛋白质数据库UniProtKB/Swiss-Prot（swis-sprot）的转录本（E-value<10-'）;（5）将剩余的转录本翻译成相应氨基酸序列，使用隐马尔可夫模型（Hidden markov models，HMMs）对Pfam蛋白质库进行比对，去除在Pfam中有对应的转录本;最终剩余的转录本为lncRNA。

1.5 差异IncRNA的保守性与重复序列分析

用HTseq对组装的转录本进行表达水平的定量分析，然后使用DEseq2对组间的lncRNA进行表达差异分析。将变化倍数（Fold change）≥2以及错误发现率FDR<0.05作为差异表达的筛选标准。通过Ensemble数据库下载入和小鼠的IncRNA序列，利用BLASTN比对程序，分析差异lncRNA与人和小鼠lncRNA之间的保守性。利用RepeatMasker网站对差异lncRNA序列中可能存在的重复序列元件类别进行在线分析。在Search engine中选择Cross_match，在DNA source中选择物种Pig，其它选择参数为默认。

1.6 差异IncRNA两侧蛋白质编码基因的GO与KEGG分析

以上述NCBI Annotation Release：106和Ensemble Release 92的蛋白质编码基因为数据库，选择差异lncRNA两侧相邻的蛋白质编码基因，使用DA-VID（Database for annotation，visualization and integrated discovery）对这些蛋白质编码基因进行GO（Gene ontology）和KEGG pathway（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析，研究这些蛋白质编码基因参与的生物学功能与途径。筛选条件选择Count=2，EASE=0.05，Fold enrichment≥1.5。

1.7 差异IncRNA定量PCR验证

对照组与试验组RNA反转录成cDNA，分别挑选2个上调和下调的lncRNA进行qPCR验证，以HPRT作为内参基因，在ABI 7500仪器上进行定量PCR反应，对照组与试验组各3个生物学重复，每个样品技术重复3次。荧光定量PCR按照试剂盒说明书操作，定量数据用2-00“法处理，差异比较采用独立样本t检验。引物序列见表1。

2 结果与分析

2.1 RNA质量及其测序文库数据分析

经过Agilent 2100 bioanalyzer检测后发现6个样本RNA的RIN为9.0～9.4，28S/18S为2.1～2.5，符合RNA测序文库的构建要求。通过在IL1B外显子_上设计不夸内含子的扩增引物来确认RNA中是否有DNA污染。我们对RNA DNase I处理前后的结果进行了验证，直接以DNase I处理前后的RNA为模板进行PCR扩增，同时以猪基因组和Pegfp-N1作为阳性与阴性对照。图1A和图1B显示在DNase I处理前，对照组与试验组的RNA里均能扩增出IL1B产物，DNaseI处理后均扩增不出IL1B产物，说明DNase I处理能消除RNA样品中的DNA。RNA测序方面，6个样本中经过RNA-Seq产出的Cleandata在6.52～7.35Gb，GC含量都在53%左右，其Q20百分比都在95%以上，Q30百分比都在90%以_上。

2.2 差异蛋白质编码基因参与的生物学过程

对猪的蛋白质编码基因分析发现，相对于对照组，试验组有1295个蛋白质编码基因呈现变化倍数。对这些差异表达的蛋白质编码基因进行GO的生物学過程分析发现，这些差异基因一共参与327个生物学进程，其中最显著富集的第1到第10个进程依次排序为GO：0006954（炎症反应）、GO：0006955（免疫反应）、GO：0032496（脂多糖反应）、GO：0071222（细胞对脂多糖反应）、GO：0050729（炎症反应的正调节）、GO：0030335（细胞迁移的正调节）、GO：0006915（凋亡过程）、GO：0009615（病毒反应）GO：0050731（肽酪氨酸磷酸化的正调节）与GO：0051607（病毒防疫反应）。这些进程涉及到炎症反应、免疫反应、脂多糖反应、炎症反应调节、细胞迁移调节、细胞凋亡、病毒响应、肽酪氨酸磷酸化等，而在这前10个进程中有7个涉及到免疫、炎症及抗病毒反应（图2）。

2.3 lncRNA的鉴定与结构分析

经过HISAT2比对和StringTie组装后的转录本经过层层过滤后最终得到1056个lIncRNA转录本，其对应于831个基因座，这些IncRNA的平均长度为1643bp，平均外显子数为2.4个。对lncRNA的长度区间进一步分析发现（图3），在200～500bp与501～1000bp的IncRNA占总数的52%，随着长度的不断增加，lncRNA所占的比例逐渐减小。而对于外显子分布的进一步分析发现，只有1个和2个外显子的lncRNA占总数的64%，随着外显子数目的不断增加，lncRNA所占的比例也逐渐减小。lIn-cRNA在不同的染色体，上都有不同程度的分布，在Y染色体上的数量最少。

2.4 差异表达IncRNA的鉴定

通过分析与比较，在对照组与试验组之间共有95个差异表达的lncRNA，相对于对照组，试验组有51个lncRNA，上调表达（表2），44个lncRNA下调表达（表3）。

2.5 差异表达IncRNA的保守性分析

Ensemble数据库中人有7856个lncRNA基因，小鼠有5438个lncRNA基因。进行BLASTN比对后，在95个差异的猪lncRNA中有10个IncRNA与人lncRNA同源;而只有1个lncRNA与小鼠ln-cRNA同源（E-value<10-5），分别占到了其總数的10.50%和1.05%，同时与人和小鼠IncRNA同源的有1个lncRNA。在与小鼠lncRNA同源的猪ln-cRNA中，其同源序列长度跨度为327～620bp，平均长度为514bp;在与人lncRNA同源的猪lncRNA中，其同源序列长度跨度为31～1301bp，平均长度为490bp。

2.6 差异表达IncRNA的重复序列分析

通过RepeatMasker分析发现，95个差异ln-cRNA中有81个lneRNA序列中含有重复元件，占到了总数量的85%。对lncRNA序列中重复元件的种类分析发现，短散在重复序列（SINE）和长散在重复序列（LINE）分别占到了重复元件总数的40.4%和17.7%，长末端重复序列（LTR）占到了11.6%，简单重复占16.9%，这几种常见的重复元件占到了总重复元件类型的86.6%，剩余的是一些不常见的类型。进一步对不同含量区间的lncRNA分析发现，以10%为1个区间，在含0～10.0%，10.1%～20.0%，20.1%～30.0%，30.1%～40.0%重复元件的lncRNA占总数的10%以上，含50%以上重复元件的lncRNA数量较少（图4）。

2.7 差异表达lncRNA两侧蛋白质编码基因的GO与KEGG分析

通过对95个差异表达的IncRNA与猪NCBI和Ensemble蛋白质数据库染色体位置比较，163个有官方名称的蛋白质编码基因处于差异IncaNa两侧。我们对这163个蛋白质编码基因进行GO与KEGG分析。在GO分析中，这些蛋白质编码基因共参与了22类生物学进程（图5）。这22类进程中涉及到信号转导、抗病毒反应、器官形态发生、细胞增殖、体液免疫等，其中6个进程与病毒反应、免疫反应相关，分别为GO：0009615（病毒反应）、GO：0006959（体液免疫反应）、GO：0051607（病毒防疫反应）、GO：0060337（I型干扰素信号通路）、GO：0070098（趋化因子介导的信号通路）、GO：0002548（单核细胞趋化性）。

对51个上调表达的IncANA两侧的蛋白质编码基因进行GO分析发现，这些蛋白质编码基因一共参与了26类生物学进程（图6）。这26类进程中涉及到信号转导、趋化因子信号通路、细胞增殖、G蛋白受体信号、器官形态发生等，其中有11个进程涉及到病毒反应、免疫反应、炎症因子，分别为GO：007008（趋化因子介导的信号通路）、GO：0006955immune response（免疫反应）、GO：000615（病毒反应）、CO0002548（单核细胞趋化性）、GO：000935（趋化性）GO：000959（体液免疫反应）、GO：000954（炎症反应）、GO：006037（I型干扰素信号通路）、GO：0030593（中性粒细胞趋化性）、GO：0051607（病毒防疫反应）、GO：0071347（细胞对白细胞介素1的反应）。对44个下调表达的IncaNa两侧的蛋白质编码基因进行GO分析发现，这些蛋白质编码基因共参与了3类生物学过程（图7）。这3个过程涉及到DNA重组、RNA聚合酶Ⅱ转录调控、心内膜垫层形成等。

对差异表达的IncANa两侧的163个蛋白质编码基因进行KEGG

pathway分析发现，这些蛋白质编码基因总共参与了6个Pathway，这些Pathway涉及到细胞因子受体结合、A型流感、Rapl信号通路美洲锥虫病、白细胞跨内皮迁移与趋化因子信号通路（图8），其中绝大部分与免疫反应、炎症反应相关。对51个上调表达的IncaNa两侧蛋白质编码基因进行KEGG

pathway分析发现，这些蛋白质编码基因总共参与了7个Pathway，这些Pathway涉及到细胞因子受体结合、A型流感、Rapl信号通路、类风湿性关节炎、美洲锥虫病、白细胞跨内皮迁移与趋化因子信号通路（图9），其中绝大部分也与免疫反应、炎症反应相关。然而对44个下调表达的Incana两侧的75个蛋白质编码基因进行KEGG pathway分析时发现没有Pathway被显著富集。

2.8 差异表达IncaNa定量PCR验证

我们在上调和下调的IncANa中分别选取2个Incana进行定量PCR验证。在上调的2个lncRNA中，Incana-MSTRG.8350的两侧蛋白质编码基因为CXCL8与CXCL6，通过上述的GO与KEGG注释显示它们与免疫反应、趋化因子通路相关;lncRNA-MSTRG.8244其两侧蛋白质编码基因RHOH与CHRM9分别与信号传导和白细胞跨内皮迁移相关，与炎症反应间接相关。下调中的Incana两侧蛋白质编码基因在GO与KEGG注释中均没有涉及到免疫反应、炎症反应、趋化因子、病毒响应，故随机选取了2个IncaNa，分别为Incana-MSTRG.3552与Incana-MSTRG.12242。定量PCR结果显示，与对照组相比Incana-MSTRG.8350和IncanaMSTRG.8244显著上调（P<0.01），IncRNA-MstrG12242和Incana-MSTRG3552显著下调（P<0.01）（图10），上调和下调差异倍数与RNA-seq的差异倍数相似，表4为qPCR差异倍数与RNA-Seq差异倍数比较。

2.9 IncANa组织表达谱

以成年猪的心脏、肝、脾、肺、肾、小肠、背肌等组织的cDNA为模板，对上述上调和下调的4个Incana进行组织表达谱分析。结果（图11）显示在上调的2个Incana中，Incana-MSTRG8350仅在肺中有微弱的表达，不表达于其他组织，Incana-MSTRG.8244在脾中表达相对较高，在肝小肠中表达较弱。在下调的2个IncaNa中，IncaNa-MSTRG.12242与IncaNa-MSTRG.3552均呈现多组织表达

3 讨论

IncaNa可通过本身的复杂结构与DNA、RNA或蛋白質之间互作，从而在多种层面上调控炎症因子的表达水平6.2。从Incana这一新的调控分子去研究炎症因子的表达调控能更加全面地理解炎症反应的机理。基于此，本研究通过RNA-Seq测序并结合生物信息学分析对猪单核源性巨噬细胞受支原体脂蛋白FSL-1刺激后的Incana进行了鉴定与特征分析。

支原体细胞膜上的脂质相关膜蛋白是其介导宿主发生天然免疫的重要抗原3，由于绝大部分支原体的脂蛋白结构是双酰基而不是三酰基6），因而我们在脂蛋白上选取了双酰基结构的FSL-1脂蛋白，这更好地模拟支原体脂蛋白对细胞的炎症反应。我们发现在脂蛋白FSL-1刺激细胞后，其差异基因参与的最显著的通路都集中在炎症与免疫反应上，这说明FSL-1刺激成功地构建了细胞炎症模型。我们在Incana的鉴定中由于Incana基因与蛋白质编码基因的起始位置不重叠，实际上得到是lincrna。lincrna由于不与其他蛋白质编码基因重叠而具有相对独立的转录单元，这也便于对其表达和调控进行更好的研究。Incana基因一般长度在1kb左右，外显子数目大多数为1～327。本研究结果显示Incana平均长度为1643bp，平均外显子数为2.4个，而且长度在1000bp以下和外显子数在2以下的Incana都占到了总数的50%以上，表现出较短的长度以及较少的外显子数，这也与报道相符合，表明我们得到的Incana是可信赖的。IncaNA基因由于部分和经典的蛋白质编码基因mRNA结构相似，也显示出一定的转录剪接28，我们鉴定的1056个IncanA转录本，其对应于831个基因座，这也说明其中有些IncaNa基因发生了选择性剪接，产生了2个以上的转录本。我们发现在差异lncRNA基因中，分别有10.50%和1.05%的Incana与人和小鼠同源，这表明相对于小鼠，猪的Incana与人的更为保守。研究结果表明基因组的重复序列可能是Incana产生的主要来源。我们对差异IncaNa的序列分析发现绝大多数的差异Incana中都含有重复序列，这也与上述结论相符。进一步分析发现短散在重复序列（SINE）占到了差异lncRNA中总重复序列种类的40%，这说明差异lncRNA可能大部分来源于基因间的短散在重复序列区间。

Incana通过顺式作用0与反式作用来发挥其重要功能，虽然目前还未有较好的方法来准确预测Incana的功能，然而通常可根据Incana的这些调控方式来预测其功能，一般对Incana两侧蛋白质编码基因参与的通路来预测Incana可能的功能。在本研究中，我们对差异IncaNa两侧的蛋白质编码基因进行GO与KEGG分析发现，在GO分类中，差异IncaNa包括上调与下调Incana两侧的蛋白质编码基因参与了22个生物学过程，其中6个与免疫反应、炎症反应直接相关，而对上调的lncRNA两侧的蛋白质编码基因分析发现，它们参与26个生物学过程，其中11个与免疫反应、炎症反应直接相关，占到了大约一半的比例;而对下调的lncRNA两侧的蛋白质编码基因分析发现，没有参与免疫反应、炎症反应的通路。这说明上调的IncaNa更倾向于富集在与免疫反应、炎症反应相关的基因两侧，可能具有重要作用。KEG的通路分析结果也与GO分析结果相符合，上调的Incana两侧蛋白质编码基因几乎都参与免疫反应、炎症反应相关的通路，而下调的Incana两侧的蛋白质编码基因没有参与生物学进程。我们进一步对上调和下调的Incana进行组织表达谱分析，结果表明位于与炎症反应相关的蛋白质编码基因两侧的2个上调In-cRNA，都呈现出一定的组织特异表达，其中一个表现出严格的组织表达，而在下调的IncaNa中与此相比都表现出多组织表达。研究结果表明，严格的组织表达或时序特异性表达的Incana具有重要功能（30321，这也在一定程度上说明了上调的IncANa尤其是位于与炎症反应相关的蛋白质编码基因两侧的IncaNa值得进一步深入研究。

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