基于网络药理学的葶苈子潜在作用机制研究

史佩玉 林樫 陈国铭 方彩珊 綦向军 侯颖跃 罗冬强 邢万里 黄睿澜 罗文婷

中图分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）20-2823-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.17

摘 要 目的：探讨葶苈子潜在的药理作用机制，为其进一步开发利用和临床应用提供参考。方法：利用中药系统药理学分析平台数据库和STRING数据库筛选并确认葶苈子的有效成分和相关靶标蛋白;运用Cytoscape 3.7.0软件构建葶苈子有效化合物-靶标蛋白可视化网络，并进行网络拓扑学分析;借助STRING数据库和Cytoscape 3.7.0软件构建并分析葶苈子靶标蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络;通过DAVID生物信息学资源数据库对靶标蛋白进行KEGG通路富集分析。结果：共筛选获得葶苈子有效化合物9个，包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等;获得靶标蛋白174个，主要包括人前列腺素内源性过氧化物合酶2（PTGS2）、核受体共激活因子2、孕酮受体等，其中转录因子AP-1（JUN）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）是PPI网络中的核心蛋白。KEGG富集通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、肿瘤坏死因子α（TNF-α）信号通路、缺氧诱导因子1信号通路、Toll样受体信号通路、甲状腺激素信号通路等。结论：葶苈子中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等有效化合物可能通過PI3K/Akt信号通路、TNF-α信号通路等作用于PTGS2、JUN、MAPK1等靶标蛋白，进而发挥泻肺平喘、利水消肿的功效。

关键词 葶苈子;网络药理学;药理作用;机制;有效化合物;靶标蛋白;信号通路

ABSTRACT   OBJECTIVE： To investigate the potential pharmacological mechanism of the seed of Draba nemorosa， and to provide reference for further development， utilization and clinical application. METHODS： Effective components and related target proteins of D. nemorosa were screened and identified by using TCMSP and STRING database. Cytoscape 3.7.0 software was used to construct a visual network of effective components and target proteins for the seed of D. nemorosa， and the network topology analysis was performed. The targeting protein-protein interaction （PPI） network was constructed and analyzed by STRING database and Cytoscape 3.7.0 software. KEGG pathway enrichment of target proteins was analyzed by DAVID bioinformatics resource database. RESULTS： A total of 9 effective components were screened from the seed of D. nemorosa， including quercetin， kaempferol， β-sitosterol， etc. Totally 174 target proteins were obtained， mainly including PTGS2， NCOA2， PGR， etc. Among them， JUN and MAPK1 were core proteins in PPI network. KEGG enrichment pathway included PI3K/Akt signaling pathway， TNF-α signaling pathway， HIF-1 signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway and thyroid hormone signal pathway， etc. CONCLUSIONS： Effective components from the seed of D. nemorosa such as quercetin， kaempferol and β-sitosterol may act on PTGS2， JUN and MAPK1 target proteins through PI3K-Akt signaling pathway and TNF-α signaling pathway， thus exert the effects of purging lung， relieving asthma， promoting edema and reducing edema.

KEYWORDS   Seed of Draba nemorosa; Network pharmacology; Pharmacological effect; Mechanism; Effective components; Target protein; Signaling pathway

葶苈子为十字花科植物播娘蒿[Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl]或独行菜（Lepidium apetalum Willd.）的干燥成熟种子，其味辛、苦，性大寒，归肺、膀胱经，具有泻肺平喘、行水消肿之功效，可用于痰涎壅肺、喘咳痰多、胸胁胀满、胸腹水肿、小便不利等症的治疗[1]。现代药理研究证实，葶苈子具有止咳平喘、强心利尿、抗肿瘤等作用，具有一定的开发价值[2]。

中药药效的物质基础由多种结构和功能各异的化合物组成，其药效的发挥也并非集中于某一特定靶标，而是涉及多个靶标[3]。作为新兴学科，网络药理学打破了原有单一的研究框架，构建了“药物-成分-靶点-疾病”的多层次网络，与中医药整体观理论相契合[4]。该学科可为从分子生物学水平阐明中药“多成分、多靶点、多通路”作用机制提供科学依据，且具有整体性和系统性的特点[5]。笔者通过查阅文献发现，目前关于葶苈子的现代药理研究多集中于其有效化学成分、药理作用、生物活性、质量控制等领域，而有关其多成分、多靶标、多途径、多效应药效作用机制的系统性研究则相对较少。为此，本研究拟采用网络药理学方法分析并预测葶苈子的潜在作用机制，以期为该药材的进一步开发利用及临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 获取葶苈子有效化合物和靶标蛋白

本研究依托中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“葶苈子”作为“Herb name”进行检索，并通过口服生物利用度（OB）和类药性（DL）来筛选葶苈子中活性较高的化合物。其中，OB是指口服药物被吸收后进入循环系统，并保持药理活性的比例，是评价活性成分药动学行为的关键指标;DL则体现了化合物与已知药物的相似性，是评价成药性高低的重要指标[3]。本研究以OB≥30%、DL≥0.18為筛选标准，对葶苈子的有效化合物及其靶标信息进行筛选，以提高数据的真实性与可靠性[6]。将葶苈子有效化合物靶标信息输入蛋白质相互作用平台STRING数据库（https：//string-db.org/），以获取其有效化合物靶标蛋白的标准名称。

1.2 构建有效化合物-靶标蛋白网络

将上述筛选所得的葶苈子有效化合物和靶标蛋白相关信息输入Cytoscape 3.7.0软件（http：/cytoscape.org/）进行可视化处理，并构建葶苈子有效化合物-靶标蛋白网络。其中，葶苈子有效化合物及靶标蛋白用节点表示，两节点间的相互作用关系用边表示。使用软件中的“Network analyzer”工具进行网络拓扑学分析，以节点度值（Degree）和中介中心度（Betweenness centrality）来评估节点的重要程度，上述参数值的大小均与对应节点在该网络中的重要程度成正比[7]。

1.3 构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络

PPI是生物分子网络中的基本组成元件，是疾病发生发展的关键环节[8]，故本研究使用STRING数据库获取靶标蛋白相互作用关系，从PPI层次探讨葶苈子的潜在作用机制。将葶苈子靶标蛋白信息输入STRING数据库，物种设为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为最高置信度“Highest confidence（0.900）”，同时设置“Hide disconnected nodes in the network”以隐藏网络中无关联的节点，其余参数均为“默认”，构建PPI关系。将上述PPI关系导入Cytoscape 3.7.0软件进行可视化处理，以获取PPI网络;以度值大于2倍平均度值为标准筛选核心靶标蛋白，并采用Excel 2010软件绘制相应蛋白的信息条形图。

1.4 KEGG通路富集分析

将葶苈子相关作用靶标蛋白的编码基因导入DAVID生物信息学资源数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）中进行KEGG通路富集分析。物种设为“Homo sapiens”，计算所有富集通路的P值，并采用Bonferroni法进行校正，P<0.01的结果被认为是“显著富集”[6]，挖掘葶苈子靶标蛋白编码基因参与的KEGG通路信息。

2 结果

2.1 葶苈子有效化合物和靶标蛋白筛选结果

从TCMSP数据库中共获得葶苈子的相关化合物68个，参照OB≥30%、DL≥0.18的标准共筛选出化合物12个;排除无对应靶标或靶标蛋白无标准名称的化合物，共筛选得葶苈子中的有效化合物9个、靶标蛋白174个，详见表1、表2。

2.2 葶苈子有效化合物-靶标蛋白网络分析结果

通过Cytoscape 3.7.0软件获得葶苈子有效化合物-靶标蛋白网络，见图1。由图1可见，该网络共有183个节点、275条边。其中，最外两圈表示度值为1的靶标蛋白，再往里两圈表示度值>1的靶标蛋白，最内圈表示葶苈子的有效化合物（其形状大小与度值成正比）。网络拓扑学分析结果显示，该网络节点的平均度值为3.005，大于该平均值的节点有10个;平均中介中心度为0.014，大于该平均值的节点有10个。根据节点度值、中介中心度等网络拓扑学特征进行核心节点的筛选，结果显示，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、常春藤皂苷元等有效化合物以及PTGS2、NCOA2、PTGS1、GABRA1、PPARG等靶标蛋白在葶苈子有效化合物-靶标蛋白网络中具有重要作用，可能是葶苈子发挥药效的核心化合物及靶标蛋白。

2.3 葶苈子靶标蛋白PPI网络分析结果

共得到靶标蛋白152个，其PPI网络见图2。由图2可见，该网络共有152个节点、629条边，平均度值为8.276。其中，96个圆形节点表示度值小于平均度值的靶标蛋白，38个三角形节点表示度值大于平均度值但小于2倍平均度值的靶标蛋白，18个正六边形节点表示度值大于2倍平均度值的靶标蛋白。

参考各节点的度值绘制核心靶标蛋白（即度值大于2倍平均度值的靶标蛋白）信息条形图，结果见图3。由图3可见，JUN、MAPK1的度值分别为36、34，大于其余靶标蛋白，在PPI网络中起枢纽作用，可能是葶苈子发挥泻肺平喘、利水消肿功效的关键靶标蛋白。

2.4 KEGG通路富集结果

共得到KEGG富集通路35条（P值均小于0.01）。采用P值和基因富集数量交叉筛选的方法，筛选出P值与基因富集数均排名前10位的信号通路，结果见表3。由表3可见，葶苈子靶标蛋白的编码基因主要富集于TNF-α信号通路、HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路、甲状腺激素信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、MAPK信号通路等。

3 讨论

葶苈子首载于《神农本草经》，可“破坚逐邪，通利水道，凡积聚寒热从水气来者，此药主之”，临床上常用以治疗痰涎壅肺、胸胁胀满、喘咳哮鸣、小便不利等症，具有很好的疗效[9-10]。中药具有多成分、多靶点、多通路的作用特点，本研究运用网络药理学从“成分-靶点-通路”水平初步探讨了葶藶子的潜在作用机制。

3.1 有效化合物和靶标蛋白

葶苈子有效化合物-靶标蛋白网络分析结果表明，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等有效化合物和PTGS2等靶标蛋白是葶苈子关键化合物与靶标蛋白。PPI网络分析结果表明，JUN和MAPK1的度值大于其余靶标蛋白。

槲皮素为天然的多羟基黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗风湿、调节免疫等作用[11-12]。相关文献报道，该化合物可缓解肺部相关疾病，并可有效减轻肺组织的损伤[13-14]。此外，在发生慢性支气管炎或肺气肿时，辅助性T淋巴细胞2（Th2）细胞和嗜酸性粒细胞含量增多，气道呈高反应性，黏液产生增多，从而导致患者气道阻塞、呼吸不畅并与黏液相搏，临床上常表现为喘咳哮鸣、胸胁胀满、痰涎壅肺，而槲皮素可通过抑制促炎介质的过度释放来发挥宣肺平喘的功效[15]。山柰酚具有抗炎、抗氧化等作用，可下调核因子κB（NF-κB）信号通路，抑制IL-6、TNF-α等炎症因子分泌，在急性肺损伤中发挥着重要的作用[16]。β-谷甾醇对脂多糖致急性肺损伤模型小鼠具有一定的保护作用，可通过阻止炎症因子的释放、抑制NF-κB信号通路的活化等途径来发挥平喘的作用[17]。

PTGS2又称环氧合酶2（COX-2），其高水平表达与机体免疫活性密切相关[18]。COX-2抑制剂可增加肺癌对放疗的敏感性，提高治疗效果，且对肺癌所致喘咳、咳痰具有一定的抑制作用[18-19]。c-jun是早期原癌基因，哮喘形成过程中产生的各种细胞因子、炎症介质等均可促进其编码产物JUN蛋白的表达[20]，是葶苈子发挥泻肺平喘功效的关键蛋白，这与笔者预测的JUN靶标蛋白在葶苈子PPI网络中具核心作用基本相符。MAPK1靶标蛋白主要存在于支气管平滑肌细胞胞浆中，能缓解气道重塑、减少炎症因子表达、调节气道炎症反应、减轻咳喘症状[21]。MAPK通路与肺癌细胞增殖、凋亡密切相关，抑制该通路的活性，可促进肺癌细胞的凋亡、抑制其增殖[22]。

据此，笔者认为葶苈子发挥泻肺平喘功效与其所含槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等有效化合物和PTGS2、JUN、MAPK等靶标蛋白有关，这些活性化合物可借助上述靶标蛋白而抑制肺和支气管炎症的发生、调节机体免疫活性、降低促炎介质的释放、减少肺与支气管黏液的生成、缓解气道阻塞。中医认为，支气管隶属肺系，为气道的分支，故抑制肺和支气管炎症的产生即抑制肺系炎症的产生，宣肺即“护肺”[23]。本研究结果与上述理论基本一致。

3.2 信号通路

KEGG通路富集分析结果显示，TNF-α信号通路、HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路、甲状腺激素信号通路、PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路等是葶苈子发挥药效的重要信号通路，其中大多数靶标蛋白的编码基因主要富集于PI3K/Akt信号通路和TNF-α信号通路。其中，PI3K/Akt信号通路可通过抑制或调节心室重构、内皮细胞迁移、能量代谢等机制改善心肌功能，起到强心作用[24]，这与葶苈子能够通过加强心肌收缩力、改善心脏泵血功能而起到利尿作用[25]相一致。因此，笔者预测葶苈子可通过调控PI3K/Akt信号通路来发挥利水消肿的功效，故而可用于治疗小便不利、胸腹水肿等症。TNF-α信号通路可促进趋化因子、促炎因子的表达，在气道黏液高分泌过程中具有重要作用[26-27]。气道黏液高分泌会导致痰液增多，而葶苈子可通过调控TNF-α信号通路来减少炎症因子和气道黏液的产生，从而达到治疗痰涎壅盛等症的目的。

4 结语

本研究基于网络药理学的方法，对葶苈子的潜在作用机制进行了分析，结果发现，葶苈子中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等有效化合物可能通过PI3K/Akt信号通路、TNF-α信号通路等信号通路作用于PTGS2、JUN、MAPK1等靶标蛋白而发挥宣肺平喘、利水消肿的功效，且上述作用具有多成分、多靶点、多通路的特点，与祖国医学的整体观不谋而合。但本研究在筛选核心化合物与靶标蛋白时存在一定的主观性，可能导致结果具有一定的局限性与片面性，故本文结论有待基础和临床研究的进一步验证。

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（收稿日期：2019-02-18 修回日期：2019-07-29）

（编辑：张元媛）