miRNA的常用检测方法研究

李一龙 闵清

摘   要：microRNA（miRNA）是一类非编码RNA，在生物体内的产生过程非常复杂。miRNA在细胞增生、细胞凋亡以及肿瘤发生过程中发挥着重要调节作用。一个miRNA具有调控多个基因的功能，多个miRNA也可以调控一个基因，这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。miRNA的这种特征为解决复杂疾病提供了新的切入点，成为潜在的癌基因或抑癌基因，是肿瘤发生发展过程中有效的标志物。

关键词：microRNA;检测方法;PCR检测;电化学

自1993年miRNA被发现以来，学者们已经找到了1 000种人类的miRNA，这些miRNA调控着人类近1/3基因的功能，参与了几乎所有生命活动的调节和大多数疾病的发病过程。机体miRNA的异常表达将导致多种疾病，其中包括恶性肿瘤与神经障碍等[1]。研究发现，miRNA基因多态性（miRNA polymorphisms）能够影响miRNA功能，是人类基因组中一类新型的基因功能多态性[2]。在染色体基因组水平上，单个核苷酸变异引起的miRNA序列多态性对miRNA的转录、形成、输出及调控具有重要影响。因此，检测miRNA在机体中的表达水平以及灵敏检测出单个核苷酸的变异对疾病诊断及药物开发具有非常重要的意义[3]。

1    miRNA检测存在的挑战

成熟的miRNA的片段较短，在细胞中的表达水平普遍低，且家族成员之间通常只有1～2个碱基的区别，基于这个原因，miRNA的精准检测在临床上存在一定的难度和挑战性。由于miRNA的序列非常短，所以它的降解温度很低且容易发生除完全互补配对以外的杂交反应，同时，单个碱基错配的序列以及miRNA也容易对检测信号产生干扰，产生假阳性结果，也为其准确检测增加了难度[4]。因此，miRNA作为一种潜在的肿瘤标志物，需要一种快速灵敏、特异性高的检测方法对其进行分析[5]。

2    miRNA的常规检测手段

随着miRNA在不同生物中的大量发现和对其功能的深入研究，miRNA的检测方法不断改进和完善，新的扩增、探针标记技术和检测技术不断被开发[6]。目前，miRNA檢测一般是基于核苷酸杂交和扩增原理，检测手段主要为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）[7]，Northern印迹（northern-blotting）[8]，微阵列芯片（microarray）[9]，原位杂交以及电化学等，这些手段需要将miRNA的杂交信号转化为可以测量的信号，从而达到定量或定性分析的目的。

2.1  Northern印迹

Northern印迹杂交是一种常用的miRNA检测方法，自1993年lin-4首次作为负调控因子被发现以来一直被研究至今，该方法将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交，然后通过探针的标记性质检测出杂交体。与传统DNA探针相比，Northern印迹杂交探针中引入锁核酸（Locking Nucleic Acid，LNA），为检测增加了10倍的灵敏度，并改善了错配的特异性检测。LNA是将核苷酸残基的一部分核糖上的2’与4’碳通过亚甲基连接在一起形成的刚性结构，作为探针大大提高了杂交序列的热稳定性、杂交效率及测定灵敏度。然而，这种方法的主要缺点之一是LNA是专有技术，与传统DNA探针相比，杂交探针的成本可能增加约50倍。

2.2  PCR检测

PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它利用DNA在体外95 ℃高温时变性成单链，60 ℃时引物与单链根据碱基互补配对的原则结合，加上对DNA聚合酶最适反应温度（72 ℃左右）的调控，能使DNA在PCR仪内良好的变性温度、复性温度和延伸温度下进行很好地扩增。PCR可以被看作生物体外的特殊DNA复制，其最大的特点是能大幅度增加DNA的量，RT-qPCR更是因为其成本、精密度和样本量之间良好的平衡关系被看作miRNA检测技术中的黄金标准，常用于验证全基因组筛查的结果，以及筛选与临床相关的miRNA亚组。然而，鉴于miRNA研究的广泛性，将RT-qPCR应用于所有这些领域存在着极大的挑战，特别是考虑到miRNA的来源广泛和用于从其提取RNA的方法的问题，对于RT-qPCR来说，其结果的质量和可靠性取决于输入RNA的质量，因为任何降解都可能导致错误，这些错误在逆转录过程和定量过程中会进一步扩大，所以在开始实验方案的实际检测部分之前，进行良好的质量控制并检查RNA的完整性非常重要，需要对miRNA样品进行提纯处理。由于miRNA的短小性，对PCR扩增引物的设计存在一定难度，并且其解旋温度较低，这在一定程度上影响了PCR检测的灵敏度及准确性。此外，由于成熟miRNA是pre-miRNA的一段序列，故pre-miRNA的存在同样会对测定结果产生干扰，造成假阳性。

2.3  微阵列芯片（microarray）

与Northern blot印迹检测相似，miRNA的微阵列分析依赖于目标miRNA与互补DNA探针之间的特异性杂交，在固体表面上集成已知序列的捕获探针，与被测组织或细胞中大量标记的miRNA进行杂交，通过检测相应位置的杂交探针，实现基因信息的快速检测，其与Northern blot印迹检测的主要区别在于它是在微阵列技术中标记的miRNA。微阵列技术是首批能够同时从一个样品大规模并行分析数百个miRNA的技术。基于microarray的检测手段可实现miRNA的高通量测定，在芯片上引入荧光基团，例如cy3，cy5等可实现miRNA的实时、定量监测。在microarray检测中引入LNA修饰的核苷酸探针可进行体内miRNA的原位杂交检测。Wienholds等利用LNA修饰的探针进行原位杂交反应，检测了100余种miRNA在动物体内的表达，获得了多种脊椎动物中miRNA的表达谱。

微阵列方法也存在一些固有的缺点，首先，它只是半定量的，并且最适合于比较不同细胞状态之间miRNA的相对表达水平。因此，该方法需要一些其他形式的验证，例如用定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）来量化表达。其次，微阵列比其他检测方法动态范围小，通常会导致倍数变化的压缩，从而低估了miRNA检测灵敏度的相对变化值。

2.4  电化学检测

电化学检测常用到DNA生物传感器，DNA生物传感器的工作原理是将单链DNA探针固定在工作电极上，再由电极作为信号传导器，将表面发生的杂交反应以电信号的形式导出，将结果显示在电脑上，通过电化学信号的大小来确认miRNA量的多少。生物传感器的结构包括一个靶序列识别层和一个信号换能器，识别层为金电极界面等，通常通过Au-S结合巯基DNA，将DNA固定在界面上，并特异性地识别靶序列与其杂交。由于DNA大多数情况的电化学惰性，需要在电化学检测中加入电化学活性识别组分，通常这些识别组分选择性地与单链DNA或双链DNA作用，再有换能器将杂交过程产生的变化转化为可识别的信号，电化学DNA传感器通常通过检测这些可识别的信号来检测杂交反应的发生。根据杂交前后信号量的变化，对靶DNA进行准确定量。电化学方法快速、简单、灵敏、成本低廉，可对核苷酸的杂交反应进行实时检测，在检测miRNA方面具有广泛的应用，在精准医学领域有着巨大的潜力。

在电化学的基础上，运用纳米结构的微电极芯片也可以实现对miRNA的超灵敏检测，许多电化学检测miRNA的方法均采用纳米粒子进行信号放大，在传感芯片上固定既可以捕获miRNA又可以捕獲检测探针的序，核苷酸酶会剪切掉未捕获miRNA靶点的序列以及错配的碱基序列而保留其完全互补杂交的序列。用具有稳定可控的高曲率金纳米结构（HCAuNSs）的跨规模生物传感界面，大大增强了DNA与酶的相互作用。更重要的是，这些分形纳米结构有效地克服了相邻探针在高密度下的聚集，并使探针更容易被目标分子接触。这些分形纳米结构具有较高的检测角度，可抑制相邻DNA探针之间的核苷酸聚集，并允许靶分子更自由地进入。这种纳米结构的微电极芯片在精准医学领域具有巨大潜力，避免了复杂的PCR扩增过程，对于单碱基错配具有较高的灵敏度和选择性。

3    结语

miRNA基因多态性能够影响miRNA功能，是人类基因组中一类新型的基因功能多态性。在染色体基因组水平上，单个核苷酸变异引起的miRNA序列多态性对miRNA的转录、形成、输出及调控具有重要影响。因此，检测miRNA在机体中的表达水平及灵敏区分单个核苷酸变异的miRNA序列，对疾病诊断及药物开发具有非常重要的意义。近年来，随着这些小的、非编码miRNA的生物功能被逐步开发，对其检测的方法也不断涌现出来，miRNA的检测方法不断改进和完善，新的扩增、探针标记技术和检测技术不断被开发，但是，将miRNA的表达与miRNA靶标关联用于临床应用具有许多困难和挑战，最直接的难度源于检测miRNA靶序列的固有不确定性。目前miRNA检测一般是基于核苷酸杂交和扩增原理，检测手段主要为聚合酶链式反应，Northern印迹，微阵列芯片，原位杂交以及电化学检测等，这些手段需要将miRNA的杂交信号转化为可以测量的信号从而达到定量或定性分析的目的。然而Northern blotting技术耗时长、操作繁琐、样品需要量大且灵敏度低;微阵列芯片技术虽然有高通量的优势，但是会受到miRNA家族类似序列交叉杂交的干扰，而降低其灵敏度并且需要昂贵的成像仪器;RT-qPCR技术具有较高的灵敏度和实用性，但由于miRNA自身的限制，对引物的设计要求很高且温度难以控制。而电化学生物传感器具有高效、灵敏、快速、简便等特点，而且电化学检测设备相对来说装置轻便、廉价、低能耗且易于微型化和集成化。因此，基于电化学技术的miRNA生物传感器具有独特的优势，在床旁检测、分子诊断等领域有极大的应用前景。

[参考文献]

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