金莲花的诱变生物学效应研究

龚佳梦 耿金鹏 曹天光 秦垒 丁兰 展永

摘要 利用快中子、返回式卫星搭载、重离子多种方式处理野生金莲花种子，研究其对金莲花生物性状及遗传物质的影响。结果表明：快中子在花部性状的作用更为显著，花形变异较多；而返回式卫星搭载的金莲花植株在叶型的变异较为明显；重离子辐照处理金莲花的分子标记结果显示，7Li250Gy（29.11%）多态性比率高于12C100Gy（21.95%）、7Li200Gy（21.87%）、12C150Gy（20.39%）；聚类分析表明，7Li 250Gy辐照产生的突变株与对照的遗传距离相对较远，其次是7Li200Gy、12C100Gy，最后是12C150Gy。本研究为金莲花优势新品种的选育提供了材料和新种质资源，也为诱变育种的应用和分子生物学水平上的研究提供了参考依据。

关 键 词 辐射；金莲花；航天；RAPD

中图分类号 Q691 文献标志码 A

金莲花（Trollius）为毛茛科金莲花亚科金莲花属植物，金莲花茎叶形态优美，花大色艳，株型紧凑，极适宜盆栽观赏；同时其茎、叶、花、籽均可入药，对多种炎症有良好的治疗效果，是常用中药材。其无毒副作用、抗菌、抗病毒的特性催生出巨大的经济价值[1]，因而金莲花需求量日益增大，野生金莲花不能满足市场的巨大需求，同时野生金莲花品质不稳定，种质资源单一，需要对野生品种进行驯化和改良。

20世纪80年代，辐射诱变育种在我国兴起，它是一种生物诱变新技术，具有变异幅度大、罕见变异多、良性变异多、频率高、且稳定快等优势，在国内外广泛使用。辐射诱变育种主要利用加速的离子轰击植物种子、胚芽、花粉等生物材料，使之基因突变，从而选育出新的品种，为优良品种的选育提供丰富的植物材料，并在植物新品种培育方面取得了良好的效果。辐射可以对小麦同一突变体造成多种变异[2]。陈肖英[3]等通过航天育种的手段选育出蝴蝶兰航蝴2号新品种，该品种既继承了原品种“内山姑娘”速生粗壮、花大色艳、花多耐开、抗逆性强、适应性好等优良特性，还形成了一系列超亲变异性状。通过使用碳离子束诱变技术，Satoru Ishikawa[4]成功地生产出了在Koshihikari这一最受欢迎的日本温带水稻品种中积累了非常低的Cd的非转基因水稻变种。张颖聪[5]等通过碳离子和质子辐射“穗中红48”番木瓜品种获得大量突变单株，有株高矮、果实长等优良性状，为之后的进一步研究提供大量素材。耿金鹏[6]通过7Li重离子辐射选育出早熟、株型、抗性等不同类型的玉米自交系210份，并组配出高产量的“福生”系列新品种。利用离子注入选育出的“京广1号”、“京广2号”莲新品种改善了对重金属和矿质元素的吸收能力[7]。目前，国内外对于金莲花主要是其所包含的有效成分的研究，例如生物碱和黄酮类，对金莲花物种保护和育种的研究报道较少[8]。选用辐射诱变方法选育金莲花优良品种的研究更是鲜有报道。采用辐射诱变育种的方法短期内选育出可稳定遗传的高产、高品质、观赏价值和药用价值更大的金莲花新品种的几率更高。李硕[9]等对当归辐射选育品种药材的结果证明无明显毒性，临床常用量安全可行，为辐射选育中药材新品种临床用药的安全有效及推广应用提供了科学依据。

返回式卫星搭载作为辐射诱变的一种延伸，具有高真空、微重力、射线种类复杂等特殊条件，可以对进入其中的植物材料诱发显著变异。航天育种具有部分品种变异幅度大，育种周期短，诱变后代群体间出现一些有利的特殊突变体的优势[10]。已经有一些关于玫瑰[11]、凤仙花[12-13]、月季[14]、菊苣[15]等花卉航天育种的研究。

本实验利用快中子、返回式卫星搭载、重离子的手段对野生金莲花种子进行诱变处理，研究当代植株的生物学效应。通过统计分析金莲花的表观性状和检测分析分子水平的多态性，探讨多种诱变方式对野生金莲花的影响，为扩大金莲花的种质资源和选育出适合现阶段生产需要的高品质金莲花品种提供一定的实验支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

辐照材料为河北省承德市围场县性状稳定的野生金莲花种子。

1.2 试验方法

1.2.1 材料辐射处理

对照组：未经任何处理的野生金莲花。

采用4种不同方式对金莲花种子进行辐照处理，分别为：

1）在中国原子能科学研究院进行的快中子辐照处理，标记为N；

2）搭载2016年4月6日发射成功的“实践十号”返回式卫星，标记为SP10；

3）在中国科学院近代物理研究所利用兰州重离子加速器国家实验室生物辐射终端（HIRFL）的12C离子对金莲花种子进行辐照处理，使用的剂量分别是100 Gy、150 Gy，标记为12C 100、12C 150；

4）在中国原子能科学研究院利用北京串列加速器核物理国家实验室生物辐射终端（HI-13）的7Li离子对金莲花种子进行辐照处理，使用的剂量分别是200 Gy、250 Gy，标记为7Li 200、7Li 250。

1.2.2 田间试验

2014年在河北省承德市围场县田间种植对照（CK），快中子（N）处理及搭载“实践十号”返回式卫星（SP10）的金莲花种子，种植期间对金莲花表观性状进行定期观察。2017年在河北省承德市围场县田间种植对照（CK）、12C离子（12C）、7Li离子（7Li）辐射处理的金莲花种子，采集其叶片―80 ℃冰箱保存，用于RAPD實验。

1.2.3 提取基因组DNA

采用植物基因组DNA提取试剂盒的方法提取金莲花基因组总DNA：提取未经辐照处理的金莲花基因组总DNA作为对照（CK），提取辐照处理12C 100、12C 150、7Li 200、7Li 250的金莲花基因组总DNA。提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测合格后使用。

1.2.4 筛选随机引物

参考李勇等[16]30种10个碱基大小的随机引物中筛选出20种用于金莲花随机多态性扩增的随机引物。20条随机引物的碱基序列如表1所示。

1.2.5 随机多态性扩增（RAPD-PCR）

植物主要性状的遗传性较低，且遗传具有复杂性，因此基于形态特征对植物品种进行选择的方法并不可靠，最好的方法是利用分子标记来检测金莲花的遗传多样性[17]。Random Amplified Polymorphic DNA（RAPD）分子标记方法普遍用于生物DNA多态性研究，具有简单、易操作、引物随机、多态性高等优势。李勇等利用DNA随机多态性扩增的方法从分子水平对不同产地的金莲花进行了亲缘关系分析，为优良品种的选育提供了参考数据。

RAPD扩增参考李勇等的反应体系及扩增程序，并略有调整。PCR反应使用Golden Easy PCR System试剂盒，25 μl反应体系：DNA模板（200 ng/μl）2 μl，2X Reaction Mix（500 μM dNTP each，20 mM Tris-HCl（pH8.3），100 mM KCl，3 mM MgCl3，其他稳定剂和增强剂）12.5 μl，Golden DNA Polymerase（2.5 U/μl）0.2 μl，随机引物（10 μmol/L）2 μl，灭菌ddH2O 8.3 μl。PCR反应在EasyCycler Gradient 96型扩增仪上完成，扩增程序：94 ℃ 40 s，94 ℃ 20 s，35 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，45个循环，72 ℃ 延伸5 min。PCR扩增结果用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并成像观察分析。

1.3 数据分析

对电泳结果进行分析，按照有带记为“1”，无带记为“0”进行统计，获得的结果用POPGENE32软件计算多态性比率。参考李谨[18]等，定义计算公式：多态性比率（%）=（每个辐照处理组多态性条带数/对照组总条带数）。定义DNA多态性比率公式为M= nd /N×100%，式中，nd表示处理组相比对照组的差异条带数目，N表示对照组总条带数目。

利用POPGENE32软件计算不同诱变处理植株间的遗传距离。用NTSYS2.10软件基于遗传相似系数的OPGMA法对不同诱变处理植株进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 快中子辐射处理对金莲花表观性状的影响

通过对金莲花表观性状的观察发现快中子辐射能够引起M1代植株花形和叶片都发生明显变异，花形变异丰富，叶片变异较少。

在图1中，N-1花朵明显大于对照（CK），花朵直径可达到10 cm，极具观赏价值，经济效益更高；此外，更是出现N-2的对生花朵，1根枝条上2朵金莲花共生；N-3花瓣层数相比对照减少，；N-4花蕊增多且杂乱；N-5部分花瓣边缘出现裂隙；N-6花瓣形状由对照组扁长型变异为短圆；N-7花瓣向花蕊处弯曲聚集，较对照组紧密。由统计知，快中子辐照处理金莲花在花形，花瓣、花蕊等多方面都发生明显变异，如表2所示。

快中子辐射金莲花植株叶片变异较少，变异株与对照相比，叶柄变长，叶片小叶缺裂程度增大，叶片变细长，如图2所示。

2.2 返回式卫星搭载对金莲花表观性状的影响

通过对金莲花表观性状的观察发现返回式卫星搭载金莲花植株花形和叶片都发生明显变异，花形变异少，叶片变异丰富繁多。

返回式卫星搭载金莲花花形变异少，只出现花瓣层数增多的变异株（图3），而叶片变异种类繁多，每一株叶片都有少许不同，图4给出了几种典型变异叶片。由图4，与对照相比，SP10-1叶片中心呈黄色，小叶缺裂程度变大，叶片变窄变长；SP10-2叶片小叶紧凑、较对照组圆润，颜色较深；SP10-3多个叶片聚集丛生；SP10-4小叶间隔大、缺裂程度变小；SP10-5、SP10-6小叶变宽、去缺裂程度变小，且由羽形（CK）变异为掌形，SP10-6较SP10-5小叶短宽；SP10-7小叶无缺裂、变宽，锯齿状叶缘变平滑，叶片呈掌形。统计可知，返回式卫星搭载的金莲花植株叶片主要变异性状为形状、宽度及小叶缺裂程度，如表3所示。

2.3 诱变金莲花的遗传多样性分析

RAPD分子标记被广泛地应用于植物品种鉴定、群体结构及遗传多样性等，它是通过观察基因组的扩增片段来反应不同品种之间遗传物质的差异情况。由于目前对金莲花基因组结构缺乏足够的认识，采用RAPD的方法对辐照处理后的金莲花进行遗传多样性分析是非常合适的。为从分子水平上进一步探索诱变金莲花植株间的差异，该研究用筛选出的20条随机引物对CK和12C100、12C 150、7Li200、7Li250诱变处理样品DNA进行遗传多样性分析。

图5是随机引物OPB-9对对照和4个不同重离子辐照处理的金莲花样品的随机多态性扩增电泳结果，箭头所指为多态性条带处，12C100分别在分子量为1 300 bp和1 500 bp处缺失1条带，而在分子量为1 400 bp处多出1条带；12C150在分子量为800 bp处缺失1条带；7Li200在分子量1 300 bp处缺失1条带；7Li250在分子量950 ～ 2 000 bp之间缺失6条带。对20条随机引物扩增结果进行统计分析得到，对照株得到185条清晰稳定扩增条带，分子量大小在200 ～ 3 000 bp之間，重离子辐照组多态性比率7Li250> 12C100>7Li200>12C150，分别为29.11%、21.95%、21.87%、20.39%（图6）。重离子辐照处理中多态性比率最高的分别是OPH-3为引物的12C100处理达到71.43%，OPA-17＼OPA-19为引物的12C150处理达到50%，7Li200处理的OPB-4高达83.33%，7Li250处理的OPB-4同样高达83.33%。

基于遗传相似系数利用NTSYS2.10软件UPGMA法对5种实验材料处理进行UPGMA聚类分析，结果如图7。由聚类分析图可知，当截取遗传相似系数水平为0.76时，对照和重离子处理材料聚为3类：对照CK和12C150在遗传相似系数0.78处聚为一类、12C100为一类，7Li250、7Li200在遗传相似系数0.83处聚为一类。用POPGENE32软件得出对照和重离子处理材料间的遗传距离，7Li250与对照组遗传距离最远为0.384 1，其次是12C150、7Li200与对照组遗传距离为0.264 5，最后12C100与对照组遗传距离最近为0.243 6。

3 结论与讨论

快中子辐照处理金莲花植株花形发生直径、对生、花瓣、花蕊等丰富变化，叶型变异较少，说明快中子在金莲花花部性状的作用更为显著，花形变异较多。李多芳[19]等在快中子辐射百日草的研究中发现，百日草叶片和花部性状均发生明显变异，其中叶片变异性状在植株生长过程中逐渐恢复，而花形花色变异种类繁多且变异性状基本稳定，与该研究结果相似。返回式卫星搭载的金莲花植株叶片在叶型、叶宽、缺裂等方面都发生了明显变异，说明返回式卫星搭载在植株叶型的变异较为明显。王曾珍[20]航天诱变普那菊苣，变异株其特征为植株高大、单株分枝数多、基茎粗大、生殖枝和小花数多。焦展[21]航天诱变油葵，得到了一系列如株高变化、叶片变化、花期延长、始花期提前、百粒质量增高等变异，推测这些变异在后代繁育中能够使油葵表现更广泛的适应性和更强大的生活力，从而有望选育出优异的品种类型。辐照后植株与对照株有明显叶片性状变化与该研究结果相似。重离子辐照金莲花遗传多态性分析显示12C100、12C150、7Li200、7Li250多态位点百分率分别为21.95%、20.39%、21.87%、29.11%。余丽霞[22]等对碳离子辐射大丽花矮化突变体的RAPD分析，在所用的25条引物中，1.80×108 /cm2剂量辐照后有18 条引物扩增出现多态性片断，扩增条带多态率19.57%； 1.08×108 /cm2剂量辐照后仅有6条引物扩增出现多态性片断，扩增条带多态率5.76%。侯岁稳[23]等在12C重离子辐照油菜诱变效应研究中，42个RAPD随机引物中有13个引物扩增出差异条带，30 Gy、90 Gy和180 Gy引起的RAPD变异率分别为22.1%、23.7%和36.2%。罗红兵[24]等对7Li辐射玉米种子引起的基因组DNA变异分析，结果全都表明辐照后的植株DNA分子都发生了明显变异且变异率差异较大。与该研究结果基本一致。辐射可有效引起金莲花表型与DNA分子的变异。从微观分子损伤到最终突变效应的出现是一个极其复杂的过程。辐射诱变金莲花的过程将发生能量沉积、动量传递和电荷交换效应，直接或间接造成金莲花的生物损伤，但由于金莲花自身的防御与修复功能，以及一系列生化代谢网络的调控，最终呈现出表观性状与基因多态性的变异[25]。快中子、返回式卫星搭载、重离子不同诱变方式均可以有效改变金莲花的遗传物质，为培育具有自主知识产权的金莲花新品种提供了技术支持，在辐照诱变育种中有广阔的应用前景。

综上所述，辐射后的金莲花当代植株不仅表观性状发生变异，DNA分子水平也发生突变，丰富了遗传多样性，为选育高产量、高品质、高观赏性的金莲花优势品种提供了材料和新种质资源。同时也为金莲花在分子生物学水平上的研究提供了参考依据。

致谢：感谢中国科学院近代物理研究所和中国原子能科学研究院对辐射实验的帮助！

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[责任编辑 杨 屹]