全自动半巢式实时荧光定量PCR技术检测BALF诊断肺结核的价值

胡立珍 周广信 霍丽丽

摘要：目的  探討全自动半巢式实时荧光定量PCR技术（GeneXpert MTB/RIF）检测肺胞灌洗液（BALF）诊断肺结核的价值。方法  采集2016年6月～2018年6月滨州市结核病防治院已经确诊的住院菌阴肺结核269例设为实验组，另收集其他肺部疾病患者87例设为对照组。利用支气管镜术收集肺胞灌洗液;肺胞灌洗液采用涂片法、培养法和GeneXpert MTB/RIF法3种方法检测结核分枝杆菌，分别对其阳性率及检测菌量进行比较。结果  BALF经涂片、培养和GeneXpert MTB/RIF3种方法检测，敏感度分别为23.05%、33.83%和62.08%，特异度分别为97.70%、97.70%和100.00%。GeneXpert MTB/RIF法分别与涂片法和培养法结果比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;涂片法与培养法结果比较，差异有统计学意义（P<0.05）;对照组涂片和培养均出现2例阳性者，而GeneXpert MTB/RIF为阴性;涂片和培养相同的2例阳性者，经基因芯片检测确定为NTM。269例菌阴肺结核BALF涂片阴性者207例，207例涂片阴性者经GeneXpert MTB/RIF法检测呈阳性者105例，其中GenXpert MTB/RIF 法“极低”量级50例，占47.62%。269例菌阴肺结核BALF培养阴性者178例，178例涂片阴性者经GeneXpert MTB/RIF法检测呈阳性者76例，其中GenXpert MTB/RIF 法“极低”量级37例，占48.68%。结论  GeneXpert MTB/RIF技术结核分枝杆菌阳性检出率高于涂片和培养法，对早期诊断肺结核具有一定的临床应用价值，且操作简单、快速，值得推广。

关键词：菌阴肺结核;结核分枝杆菌;GeneXpert MTB/RIF 技术

中图分类号：R521                                   文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.15.056

文章编号：1006-1959（2019）15-0165-03

Abstract：Objective  To investigate the value of automatic semi-nested real-time PCR （GeneXpert MTB/RIF） in the detection of pulmonary lavage fluid （BALF） for the diagnosis of tuberculosis.Methods  From June 2016 to June 2018， 269 cases of hospitalized sputum tuberculosis diagnosed by Binzhou City Tuberculosis Hospital were set as experimental group， and 87 cases of other lung diseases were collected as control group. The lung cell lavage fluid was collected by bronchoscopy. The lung cell lavage fluid was tested by smear method， culture method and GeneXpert MTB/RIF method to detect Mycobacterium tuberculosis. The positive rate and the amount of bacteria were compared.Results  BALF was tested by smear， culture and GeneXpert MTB/RIF in three methods. The sensitivity was 23.05%， 33.83% and 62.08%， respectively， and the specificities were 97.70%， 97.70% and 100%， respectively. The results of GeneXpert MTB/RIF method were statistically significant compared with the results of smear method and culture method （P<0.05）. The difference between smear method and culture method was statistically significant （P<0.05）. Two positive cases were found in the smear and culture， while the GeneXpert MTB/RIF was negative; the two smears and the same positive ones were identified as NTM by gene chip detection.207 of the 269 cases of BALF smear negative for bacterial negative pulmonary tuberculosis were detected by GeneXpert MTB/RIF method， and 105 of the 207 cases were positive， among which 50 cases （47.62%） were "extremely low" in GenXpert MTB/RIF method.178 of the 269 cases were negative in BALF culture， and 76 of the 178 cases were positive by GeneXpert MTB/RIF method， among which 37 cases （48.68%） were "extremely low" in GenXpert MTB/RIF method.Conclusion  The positive detection rate of Mycobacterium tuberculosis by GeneXpert MTB/RIF technique is higher than that of smear and culture method. It has certain clinical application value for early diagnosis of tuberculosis， and its operation is simple and rapid， which is worthy of promotion.

Key words：Sputum tuberculosis;Mycobacterium tuberculosis;GeneXpert MTB/RIF technology

目前，涂阴肺结核的诊断仍主要依靠影像学检查，影像学对肺部异常阴影的发现率高，但特异性较差，难以定性。临床上诊断菌阴肺结核已成为当前结核病控制的难点和热点。临床上超过50%的肺结核患者为菌阴肺结核病例[1]。菌阴肺结核如不给予治疗，约50%发展为涂片阳性，成为新的传染源。严格地说，痰及病变组织中查出结核杆菌是诊断结核病的金标准，胸部影像学检查不能确诊肺结核。痰的细菌学检查被认为是诊断肺结核的唯一方法。但是细菌的检出结果受诸多因素的影响，使得检出率较低，如果单纯以痰结核菌检查作为唯一的诊断标准，势必造成大部分结核患者漏诊。本文采用全自动半巢式实时荧光定量PCR技术（GeneXpert MTB/RIF）对菌阴肺结核的支气管肺胞灌洗液（BALF）进行检测，为提高菌阴肺结核临床的诊疗水平提供参考。

1材料与方法

1.1一般资料  采集2016年6月～2018年6月滨州市结核病防治院已经确诊的住院菌阴肺结核患者269例设为实验组;其中男性181例，女性88例;年龄22～65岁，平均年龄41.6岁。另收集其他肺部疾病患者87例设为对照组，其中男性53例，女性34例;年龄31～72岁，平均年龄50.3岁;肺癌34例、支气管炎21例、细菌性肺炎19例、肺气肿9例、尘肺4例。研究纳入患者均能顺利采集到支气管肺胞灌洗液。本研究经医院伦理委员会审批，并均知情同意且签署知情同意书。

1.2菌阴肺结核的诊断標准  菌阴肺结核诊断标准参照有关资料[2]，为3次痰涂片及1次培养阴性的肺结核：①典型肺结核临床症状和胸部X线表现;②抗结核治疗有效;③临床可排除其它非结核性肺部疾患;④PPD（5U）强阳性，血清抗结核抗体阳性;⑤痰结核菌PCR和探针检测呈阳性;⑥肺外组织病理证实结核病变;⑦BALF检出抗酸分支杆菌;⑧支气管或肺部组织病理证实结核病变。具备①～⑥中3项或⑦～⑧条中任何1项可确诊。

1.3标本采集  由临床医师行纤维支气管镜术，留取BALF盛于专用容器中，每例各留取1份，每份至少10 ml送检;由实验室人员将每份标本倒入离心管，3000 r/min离心集菌30 min，弃去上清液留取沉淀物约2 ml备用。

1.4主要检测仪器与试剂  GeneXpert MTB/RIF系统由美国Cepheid公司生产，试剂盒原装进口，由天津仪美科技有限公司提供。

1.5检测方法  分别从两组沉淀物中，各吸取0.05 ml至载玻片上涂抹成10 mm×20 mm卵圆形大小，自然干燥后，进行萋尼氏染色镜检抗酸杆菌（AFB）;每例再吸取沉淀物1 ml于另一专用容器中，加入等量4%氢氧化钠处理15 min，分别吸取0.1 ml接种酸性罗氏培养基上，37℃孵育，4周报告结果;涂片和分离培养按《结核病实验室检验规程》[3]要求;将剩余标本约1 ml，加入Xpert MTB/RIF处理液2 ml，盖紧剧烈摇动10～20次，室温处理15 min后，用无菌吸管吸取2 ml，加入Xpert MTB/RIF Cartridge中的标本孔中，注意防止产生气泡，盖紧盖子后上机开始测试。

1.6染色结果判定标准  抗酸染色镜检AFB，据涂片AFB菌量多少判为4+、3+、2+、1+、阴性，AFB≥10条/每个视野为4+，AFB 1～9条/每个视野为3+，AFB 1～9条/10个视野为2+，AFB 3～9条/100个视野为1+，连续观察300个视野未发现AFB为阴性;结核分枝杆菌培养法，据培养基上菌落覆盖斜面多少判为4+、3+、2+、1+、阴性，菌落铺满培养基斜面为4+，菌落占培养基斜面的3/4为3+，菌落占培养基斜面的1/2为2+，菌落占培养基斜面的1/4为1+，培养基斜面无菌落生长为阴性。GeneXpert MTB/RIF结果判断依照探针的循环阈值（ct值）[4]，当内对照探针ct值≤38即为阳性，5个探针中至少2个探针ct值≤38即为检测到MTB，可进一步按ct值对MTB进行半定量，ct值<16为高含量，ct值16～22为中含量，ct值22～28为低含量，ct值>28为极低含量 。敏感度为实验组阳性例数/实验组总例数，特异度为对照组阴性例数/对照组总例数。

1.7统计学方法  建立Excel数据库收集数据，运用SPSS 17.0软件进行统计学处理分析，计数资料使用（%）表示，不同方法检测结果比较采用？字2检验，P<0.05表明差异具有统计学意义。

2结果

2.1涂片、培养和GeneXpert MTB/RIF法3种方法检测结果比较  两组BALF经涂片、培养和GeneXpert MTB/RIF 3种方法检测，敏感度分别为23.05%、33.83%和62.08%，特异度分别为97.70%、97.70%和100.00%。GeneXpert MTB/RIF法与涂片法结果比较，差异有统计学意义（？字2=83.823，P=0.000）;GeneXpert MTB/RIF法与培养法比较，差异有统计学意义（？字2=43.016，P=0.000）;涂片法与培养法比较，差异有统计学意义（？字2=7.681，P=0.006）;对照组涂片和培养均出现2例阳性者，而GeneXpert MTB/RIF为阴性;涂片和培养相同的2例阳性者，经基因芯片检测确定为NTM，见表1。

2.2涂片、培养和GeneXpert MTB/RIF法3种方法检测菌量比较  269例菌阴肺结核BALF涂片阴性者207例，207例涂片阴性者经GeneXpert MTB/RIF法检测呈阳性者105例，其中GenXpert MTB/RIF 法“极低”量级50例，占47.62%（50/105）。269例菌阴肺结核BALF培养阴性者178例，178例涂片阴性者经GeneXpert MTB/RIF法检测呈阳性者76例，其中GenXpert MTB/RIF 法“极低”量级37例，占48.68%（37/76）。269例菌阴肺结核BALF，3种方法检测菌量情况见表2。

3讨论

结核病的病原菌是结核分枝杆菌，结核分枝杆菌感染是患结核病首要和必须的基本条件，由于涂片法和培养法敏感度较低，致使阳性检出率较低而出现“菌阴”肺结核。菌阴肺结核是指以痰涂片和培养法（3次涂片1次培养）检查分枝杆菌均为阴性的活动性肺结核。涂片和培养结核分枝菌的阳性或阴性检出受多种因素的影响：①标本的质量和性质;②病变在肺野的位置;③病变是封闭或开放;④病变的性质和其中能够排出的菌量及排出時间间歇;⑤结核分枝杆菌存在的形态;⑥培养标本含有的菌量和是否为活菌;⑦培养前处理的过程中，结核分枝杆菌损伤程度;⑧培养基营养成分的有限性等[3]。由于菌阴肺结核较难获得细菌学依据，临床诊断在综合分析患者的症状、体症、影像学及实验室检查结果的同时，及时获得来自患者病变处标本的GeneXpert MTB/RIF法检测结果是十分必要的。

GeneXpert MTB/RIF试验以半巢式实时定量PCR技术为基础、以rpoB基因为靶基因，自动提取DNA后扩增rpoB基因的192 bp片段进行检测，同时采用6中分子信标同时检测6种探针，其中5个互相重叠的分子探针（分别以探针A～E命名）选择性覆盖rpoB基因的81 bp核心区，用于检测利福平耐药，另有一个球芽孢杆菌（Bacillus globigii）特异探针作为内对照，以判断DNA扩增效率及检测效率。GeneXpert MTB/RIF技术整合了PCR检测所需要的样品准备、DNA扩增、检测3个步骤，标本准备完全实现自动化，检测全过程不足2 h完成。

本研究结果显示，3种方法检测BALF中，GeneXpert MTB/RIF法特异度为100.00%，阳性检出率高于涂片法及培养法，对照组涂片和培养均出现2例阳性者，而GeneXpert MTB/RIF为阴性;涂片和培养相同的2例阳性者，经基因芯片检测确定为NTM。与国内报道菌阴肺结核BALF涂片阳性率在12%～30%，BALF培养阳性率在25.4%～73.1%，GeneXpert MTB/RIF法阳性率在32.8%～80%[5-7]，结果相差较大，可能与患者的个体化及取材有关，研究对象和标本量的不同、标本留取的数量和处理方法的不同、实验方法的不同等均会影响阳性检出率。但报道中GeneXpert MTB/RIF法阳性率均显著高于涂片法和培养法。本研究涂片阴性者中，GenXpert MTB/RIF 法阳性检出了105例，其中其中GenXpert MTB/RIF 法“极低”量级50例，占47.62%（50/105）;培养阴性者中，GenXpert MTB/RIF 法阳性检出了76例，其中GenXpert MTB/RIF 法“极低”量级37例，占48.68%（37/76）。提示GenXpert MTB/RIF 试验的优势在于检测结核杆菌含量较低的标本。

GeneXpert MTB/RIF技术操作简便，快速，阳性检出率较高，该技术的应用对菌阴肺结核诊断具有一定的临床应用价值。

参考文献：

[1]杜正新，唐卫红，林晓珊，等.菌阴肺结核患者早期发现的探讨[J].国际医药卫生导报，2014，20（13）：1854-1856.

[2]陈子芳，孙本海，魏海冬，等.GeneXpertMTB/RIF技术对菌阴肺结核患者辅助诊断的价值[J].中国防痨杂志，2016，38（10）：827-831.

[3]赵雁林，逄宇.结核病实验室检验规程[M].北京：人民卫生出版社，2015：18-38.

[4]陈子芳，劳海黎，李秀华，等.全自动医用PCR分析系统在肺外结核诊断及利福平耐药检测中的应用价值[J].中华结核和呼吸杂志，2016，39（7）：529-533.

[5]张志学，苍爱泽，孙静.应用GeneXpertMTB/RIF技术检测肺泡灌洗液对菌阴肺结核的临床诊断价值[J].结核病与肺部健康杂志，2017，6（2）：128-130.

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[7]张杨，潘璞.GenexpertMTB/RIF技术在菌阴肺结核支气管灌洗液检测中的应用价值研究[J].中国医疗器械信息，2016，（12）：98-99.

收稿日期：2019-3-20;修回日期：2019-3-29

编辑/肖婷婷