黄瓜抗感材料接种尖孢镰孢菌后根系游离氨基酸的差异分析

李亚莉 侯 栋 岳宏忠 张东琴

（甘肃省农业科学院蔬菜研究所，甘肃兰州730070）

黄瓜是世界广泛种植的蔬菜作物，其种植面积位居我国保护地之首，对我国蔬菜的均衡供应及市场的稳定起着非常重要的作用（周红梅 等，2015）。黄瓜枯萎病是一种土传病害（Shen et al.，2008；乔永旭 等，2015），由尖孢镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）引起，又叫死秧病、蔓割病、萎蔫病，是由土壤或种子带菌传播，从根部侵入，在维管束中寄生的系统性 病 害（Zhao et al.，2012；Zhang et al.，2013；Zhang et al.，2014；石延霞 等，2015）。尖孢镰孢菌在土壤中有很强的隐蔽性，对不良环境有极强的抵抗力，能以菌丝体、厚垣孢子在土壤和空气中存 活5～6 a，甚 至10 a 以 上（Vakalounakis &Chalkias，2004；Wu et al.，2014），在适宜的条件下能快速繁殖，导致病害发生。枯萎病发生后会造成严重的经济损失，甚至绝收。土传病害的防治一直是科学研究领域的难题（Aleandri et al.，2015）。目前，化学防治黄瓜枯萎病易造成土壤和环境的污染，轮作倒茬虽然有效，但给菜农的茬口安排带来困难，嫁接防治效果较好，但成本较高且需较好的嫁接技术，相比之下，选育抗枯萎病的黄瓜新品种是最安全、经济、高效的方法（毛爱军 等，2008；Huang et al.，2012；Mehta et al.，2014；高长敏 等，2018）。但由于目前对黄瓜抗枯萎病机理的研究不够深入，造成抗病品种的选育周期较长，不能及时有效解决生产实际。

氨基酸是植物氮代谢中的重要代谢产物，它以游离态、多肽和蛋白质的形式存在。游离氨基酸是病原菌的营养物质，可被病原菌当作氮源、碳源吸收利用，合成自身的蛋白质。有些氨基酸对病原菌有致害作用，参与植物的抗病机制（单治国 等，2017）。根系是合成游离氨基酸的重要场所。目前，对接种病原菌后抗感材料根系游离氨基酸的动态变化缺乏深入而全面的研究。因此，本试验对接种尖孢镰孢菌后的抗感黄瓜根系进行游离氨基酸种类及其含量比较，以期从病原菌和植株根系游离氨基酸互作角度，揭示黄瓜抗枯萎病的生理机制，为选育抗枯萎病的黄瓜新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黄瓜抗病品系（T111）和感病品系（R00950）均由甘肃省农业科学院蔬菜研究所提供。供试菌种为尖孢镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum）4 号生理小种，由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供。

1.2 试验设计与处理

2018 年4 月将供试黄瓜品系播种于本所育苗温室，同时在甘肃省测试中心实验室完成游离氨基酸含量的测定。苗期接种采用翁祖信的胚根接种法，稍有改动。孢子悬浮液的制备：将保存备用的尖孢镰孢菌菌种接种到PDS 培养基中，待培养皿中布满菌丝后，倒入少许灭菌水，刮取菌丝，用双层纱布过滤，除去菌丝，将滤液经5 000 r · min-1离心10 min，取其沉淀物，加蒸馏水稀释成含孢子1×106个 · mL-1的孢子悬浮液备用。接种方法：将催芽后胚根长约1 cm 的种子，浸入配制好的孢子悬浮液中30 min，然后倒出孢子悬浮液，将种子播于育苗盘中。未接种对照用同法浸入灭菌水中相同时间。试验共4个处理，即抗病、感病材料对照（CK）和抗病、感病材料接种病原菌处理（I）。每天视基质湿度适量浇水，并随机挪动育苗盘。

1.3 游离氨基酸含量测定方法

接种病原菌之后8、12、16、20 d 采样，每次采样各处理3 次重复，每重复20 株苗。游离氨基酸含量测定使用氨基酸全自动测试仪，检测方法参照GB/T 18246—2000：称取3 000 mg 的植物样品放入研钵中，准确加入15 mL 的3%磺基水杨酸溶液进行研磨，转移至50 mL 的离心管中，在10 000 r · min-1下离心5 min，准确吸取1 mL 上清液，浓缩近干，准确加入1 mL 样品稀释液，利用漩涡仪复溶，过0.22 μm 过滤头，上机。测定的游离氨基酸共34 种：分别为磷酸丝氨酸、牛磺酸、磷乙醇胺、尿素、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、α-氨基已二酸、甘氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β-丙氨酸、β-氨基异丁酸、γ-氨基丁酸、组氨酸、3-甲基组氨酸、1-甲基组氨酸、肌肽、色氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、羟脯氨酸和脯氨酸。

1.4 数据处理

试验数据用Microsoft Excel 和SPSS 16.0 软件进行处理、统计分析和显著性水平检验，数据均为“平均数±标准偏差”格式。

2 结果与分析

2.1 抗感材料根系游离氨基酸总量的变化

图1 抗感材料根系游离氨基酸总量的变化

试验发现（图1），随着接种后时间的延长，抗病材料接种病原菌处理和对照的根系游离氨基酸总量均呈下降趋势。接种后8、12、16 d 和20 d，抗病材料接种病原菌处理的游离氨基酸总量分别为421.38、506.23、368.51、250.35 μg · g-1（FW），抗病对照的游离氨基酸总量分别为385.29、364.68、276.88、199.14 μg · g-1（FW），各时间点游离氨基酸总量均表现为接种病原菌处理高于对照，较对照分别增加了9.37%、38.81%、33.09%、25.72%。随着接种后时间的延长，感病对照的游离氨基酸总量呈下降趋势，而感病材料接种病原菌处理的游离氨基酸总量呈上升趋势。接种后8、12、16 d 和20 d，感病材料接种病原菌处理的游离氨基酸总量分别为339.51、419.77、410.17、448.43 μg · g-1（FW），感病对照的游离氨基酸总量分别为283.17、280.81、203.95、145.14 μg · g-1（FW），各时间点游离氨基酸总量也表现为接种病原菌处理高于对照，分别较对照增加19.89%、49.49%、101.11%、208.96%。以上试验结果表明，接种后4 个时间点，感病材料接种病原菌处理的游离氨基酸总量较对照增加的百分比均较抗病材料高，说明感病材料根系游离氨基酸总量受病原菌的影响较大。

2.2 抗感材料根系游离氨基酸种类和含量变化

从表1 可以看出，抗病材料根系共检测出25种游离氨基酸，感病材料根系共检测出24 种游离氨基酸。抗病材料游离氨基酸含量在0.45～69.60 μg · g-1（FW）之间，感病材料游离氨基酸含量在0.45～68.92 μg · g-1（FW）之间。接种后8、12、16 d 和20 d，抗感材料大部分游离氨基酸表现为接种病原菌处理大于对照或与对照差异不显著，少部分游离氨基酸表现为接种病原菌处理小于对照。尿素、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、 γ-氨基丁酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸在抗感材料的4 个时间点均表现为接种病原菌处理显著大于对照或与对照差异不显著。磷酸丝氨酸在抗感材料的4 个时间点均表现为接种病原菌处理显著小于对照或与对照差异不显著。接种后8、12、16 d 和20 d，β-丙氨酸和鸟氨酸在抗病材料中表现为接种病原菌处理小于对照，而在感病材料中表现为接种病原菌处理显著大于对照；亮氨酸则相反，在抗病材料中表现为接种病原菌处理显著大于对照，而在感病材料中表现为接种病原菌处理小于对照。

随着接种后时间的延长，抗感材料大部分游离氨基酸含量呈下降趋势，少部分游离氨基酸含量呈上升趋势。抗感材料接种病原菌处理和对照中，磷酸丝氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和β-丙氨酸均呈下降趋势。天冬酰胺的含量在抗感材料接种处理及对照中均不断增加。天冬氨酸和赖氨酸在抗病对照中呈下降趋势，而在感病材料接种病原菌处理及对照中含量不断增加。尿素和精氨酸的含量在抗病材料接种病原菌处理和对照、感病材料对照中均呈下降趋势，而在感病材料接种病原菌处理中含量增加。γ-氨基丁酸在抗病材料接种病原菌处理及对照中含量增加，而在感病对照中呈下降趋势。组氨酸和鸟氨酸的含量在抗病材料接种病原菌处理和对照、感病材料接种病原菌处理中呈上升趋势，而在感病材料对照中呈下降趋势。

3 结论与讨论

游离氨基酸又叫非蛋白质氨基酸，呈游离态，其种类和数量多于蛋白质氨基酸（徐军 等，2018 ）。植物组织中的游离氨基酸占总氮的 2%左右，但对植物的生长至关重要。游离氨基酸是植物的重要氮源，也是一种重要的生物活性物质（Egydio et al.，2013），有些游离氨基酸有促进生长、新陈代谢、免疫的功能（Cylwik et al.，2005；Morris et al.，2005；Mateo et al.，2007；李倩倩 等，2018），植物组织中的游离氨基酸能直接或间接对环境中生物或非生物的压力作出响应（Hoff et al.，1994；Ashraf & Harris，2004），如干旱、寒冷、修剪伤害、盐分、重金属、温度、大气污染、水压力、病虫害、营养等。这些环境压力会使植物中游离氨基酸浓度发生改变，大多数植物在面对环境压力时，会通过增减氨基酸浓度调节植物中氮代谢（Zhang et al.，2012），这种抵御方式降低了环境压力对植物造成的伤害（Bohnert，1995）。植物根系同化、吸收的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。根系中大多数氨基酸在低浓度下可作为一种碳源，被病原菌吸收利用，但其吸收利用的过程不够清楚。游离氨基酸总量的变化与植株的抗病性、植株部位、侵染状态和时间均有关系。本试验结果表明，接种病原菌后16、20 d，感病材料接种病原菌处理的游离氨基酸总量分别高于抗病材料接种病原菌处理。这与前人研究结果一致（蒋玉蓉 等，2005；Hao et al.，2010；董鲜 等，2015；董艳 等，2015）。董鲜等（2015）对香蕉幼苗接种尖孢镰孢菌，结果表明，接种后4、8、12 d 和16 d，根系中大部分游离氨基酸表现为未侵染植株大于侵染植株。而本试验结果表明，接种病原菌后，抗病材料游离氨基酸总量呈下降趋势，感病材料游离氨基酸总量呈上升趋势。接种后8、12、16、20 d，抗病材料游离氨基酸总量分别较对照增加9.37%、38.81%、33.09%、25.72%，感病材料分别较对照增加19.89%、49.49%、101.11%、208.96%，游离氨基酸总量受病原菌的影响表现为感病材料大于抗病材料。造成研究结果不同的原因可能是由于寄主、病原菌专化型和生理小种的不同。

表1 抗感材料根系游离氨基酸种类和含量变化 μg · g-1（FW）

病原菌侵染对不同游离氨基酸的影响研究较多，如病原菌侵染后，丝氨酸、丙氨酸经丙酮酸形成乙酰CoA，后者进入三羧酸循环，从而拮抗病原菌入侵、加强呼吸作用（沈同 等，1991）。前人研究结果表明，根系氨基酸种类和含量与枯萎病抗性密切相关，且在不同作物间有较大的差异（董艳等，2014，2015；董鲜 等，2015），但对同一作物不同抗性品种的比较研究甚少。本试验结果表明，抗感材料游离氨基酸种类相当。接种后8、12、16 d 和20 d，β-丙氨酸和鸟氨酸在抗病材料中表现为接种病原菌处理小于对照，而在感病材料中表现为接种病原菌处理显著大于对照。亮氨酸在抗病材料中表现为接种病原菌处理显著大于对照，而在感病材料中表现为接种病原菌处理小于对照。陈宏宇（2005）研究表明，天冬氨酸、苯丙氨酸等具有促进病原菌菌丝生长的功能，董艳等（2014）研究表明，赖氨酸、精氨酸等具有抑制病原菌生长的功能。张宁等（2008）的研究表明，当尖孢镰孢菌侵染西瓜时，西瓜根系中精氨酸等15 种游离氨基酸的含量显著升高。γ-氨基丁酸是植物组织中的生理活性物质，对促进生长、调节代谢、抵抗逆境和抵制病菌侵染均有利（单治国 等，2017）。而本试验结果表明，随着接种时间的延长，赖氨酸、尿素和精氨酸在抗病材料接种病原菌处理中呈下降趋势，而在感病材料接种病原菌处理中含量增加；γ-氨基丁酸在抗病材料接种病原菌处理及对照中含量增加，而在感病对照中呈下降趋势。

本试验仅对接种后抗感材料根系游离氨基酸种类及其含量进行了研究，初步总结出接种尖孢镰孢菌后根系游离氨基酸在抗感材料中的差异，对引起部分游离氨基酸含量不同的原因及机理还需进一步的研究。本试验结果将为选育抗枯萎病的黄瓜新品种提供理论依据。