RCAS1/EBAG9与P53蛋白在肝内胆管癌中的表达及临床意义

王逸君，徐自强，王志明，乐冬友，袁伟杰，许可

（郴州市第一人民医院 1.急诊科 3.重症医学科，湖南 郴州 423000；2.中南大学湘雅医院 普通外科，湖南 长沙 410008）

肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）起源于次级胆管以及分支上皮细胞的恶性肿瘤[1]，可沿着胆管周围或纵行浸润生长，转移及侵袭能力极强[2]，严重危害着人们的身体健康[3]。目前根治手术仍然是治疗ICC的最佳治疗方案[4]，但大多数患者确诊时为时已晚，无法手术治疗[5-7]。近年发现了一种新的癌抗原RCAS1，即表达于人子宫腺癌细胞株（SiSo）上的与受体相关肿瘤抗原，后来被证实与雌激素受体结合片断相关基因9（estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9，EBAG9）为同种蛋白[8-9]，RCAS1/EBAG9高表达的患者往往预后不良，而人类恶性肿瘤中多数存在P53突变，但在ICC中RCAS1/EBAG9与P53蛋白的研究很少。本研究旨在探讨RCAS1/EBAG9与P53蛋白在ICC中的表达及临床意义，试图为早期临床诊治ICC提供新的靶点，从而为ICC的诊治提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源及分组 ICC组织41例：男23例，女18例；年龄34～74岁,平均（55.35±13.02）岁，术前均未行放疗、化疗及免疫治疗。标本收集于2008年7月—2013年10月湘雅医院经过外科手术患者，按WHO病理分级标准分：低分化癌25例，中高分化癌16例；按临床病理分型：肿块型26例，管周浸润型6例，混合型9例；按组织学分型分：腺癌27例，乳头状腺癌8例，其他类型癌6例；按淋巴结转移分：转移28例，无转移13例；按肝外侵犯分：侵犯5例，无侵犯36例；按TNM分期：I～II期10例，III-IV期31例；按病灶个数：单个34例，多个7例；按最大直径分：＞5 cm 24例，＜5 cm 17例；按术前血清CEA水平：正常26例，升高15例；按术前血清CA19-9水平分：正常22例，升高例19例；按术前血清AFP水平分：正常35例，升高6例。正常胆管组9例，标本均取自胆管结石患者行Roux-en-Y胆肠吻合的正常胆管组织，男 4例，女5例；年龄32～71岁，平均（51.61±7.17）岁。上述组织放入10%福尔马林中固定，并包埋在石蜡块中，以备免疫组化用，蜡块作3～4 μm的切片3张，其中1张行HE常规染色，另2张分别行RCAS1/EBAG9、P53免疫组化检测，且HE常规染色均由湘雅医院病理科高年资医生病理检查证实。

1.1.2 抗体 RCAS1/EBAG9抗体（鼠抗人单克隆抗体22-1-1）购自美国Proteintech公司，适用的稀释浓度为1:75。小鼠抗人P53单克隆抗体（DO-7），购自北京中杉金桥公司,适用的稀释浓度分别为1:50。免疫组化试剂盒购自上海晶美生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化学步骤 采用SP法检测RCAS1/EBAG9与P53的表达。检测方法按试剂盒说明书进行，用已知阳性的正常前列腺组织切片作为RCAS1/EBAG9 的阳性对照。以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 结果判断 每张切片随机连续观察5个高倍视野，每处视野计数100个细胞。结果判定标准：RCAS1/EBAG9免疫组化染色以细胞浆或/和胞核中出现棕黄色颗粒为阳性，采用半定量积分法统计检测结果。具体评分标准[10]：⑴ 着色强度:无着色为0分、淡黄色为1分、黄色为2分、深棕黄色为3分；⑵ 阳性细胞数：无阳性细胞为0分、＜25%为1分、25%～50%为2分、＞50%为3分。⑴⑵项相加，0～2分为阴性（-）、3～4分为阳性（+）、5～6分为强阳性（++）。P53免疫组化染色以细胞核中出现棕黄色物质为阳性表达（+），无棕黄色物质为阴性表达（-）。

1.3 随访资料

通过门诊复查以及电话联系进行随访。生存时间以月计算，自手术当天起开始计算生存时间。如果死亡原因为ICC复发导致患者死亡，则以死亡日期为截止日期，若在最后截止日期患者仍然生存则以最后1次随访日期为截止日期，另外，将死于ICC以外原因归为失访，本研究最后随访截止日期2018年10月31日。

图1 免疫组化检测RCAS1/EBAG9与P53蛋白表达（SP×400） Figure1 Immunohistochemical staining for expressions of RCAS1/EBAG9 and P53

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0对实验数据进行统计分析。采用四格表资料的χ2检验或Fisher确切概率法，Wilcoxon秩和检验，双变量Spearman's相关分析，Kaplan-Meier法绘制生存曲线及Log-rank检验对术后生存率分析，采用Cox回归模型进行单因素及多因素生存分析。检验结果取双侧，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RCAS1/EBAG9蛋白与P53蛋白在ICC组织中的表达

在41例ICC组织中RCAS1/EBAG9蛋白阳性率为78.0%，9例正常胆管组织RCAS1/EBAG9蛋白无表达，ICC组织RCAS1/EBAG9蛋白阳性率明显高于正常胆管组，差异有统计学意义（χ2=46.61，P=0.000）；在41例ICC组织P53蛋白阳性率为43.9%，9例正常胆管组织P53蛋白无阳性表达，ICC组织P53蛋白阳性率明显高于正常胆管组，差异有统计学意义（χ2=23.06，P=0.000）（图1）（表1）。

表1 RCAS1/EBAG9蛋白与P53蛋白在ICC组织和正常胆管中的阳性表达率比较[n（%）]Table1 Comparison of the positive expression rates of RCAS1/EBAG9 and P53 proteins in ICC and normal bile duct tissue [n (%)]

2.2 RCAS1/EBAG9与P53蛋白表达与ICC临床病理特征的关系

RCAS1/EBAG9蛋白表达与ICC肿瘤直径（χ2=4.495，P=0.034）、病理分级（χ2=5.341，P=0.021）、TNM分期（χ2=4.101，P=0.043）以及淋巴结转移（χ2=4.604，P=0.032）有关，与年龄、性别、部位、病理分型、组织学分型、病灶个数、肝外侵犯肝外以及术前血清CEA、CA19-9与AFP水平无关（均P＞0.05）；P53蛋白表达与ICC肿瘤直径（χ2=4.894，P=0.027）、病理分级（χ2=6.740，P=0.009）以及TNM分期（χ2=4.486，P=0.034）有关，与年龄、性别、部位、病理分型、组织学分型、TNM病灶个数、肝外侵犯以及术前血清CEA、CA19-9与AFP水平无关（均P＞0.05）（表2）。

表2 RCAS1/EBAG9与P53表达与ICC患者临床资料的关系 [n（%）] Table2 Relations of RCAS1/EBAG9 and P53 expressions with clinicopathologic features of ICC patients [n (%)]

表2 RCAS1/EBAG9与P53表达与ICC患者临床资料的关系 [n（%）] （续）Table2 Relations of RCAS1/EBAG9 and P53 expressions with clinicopathologic features of ICC patients [n (%)] (continued)

2.3 ICC组织中RCAS1/EBAG9与P53蛋白表达的相关性

双变量Spearman's秩相关分析结果显示，RCAS1/EBAG9与P53蛋白表达正相关（r=0.329，P=0.018）（表3）。

表3 ICC组织中RCAS1/EBAG9与P53蛋白表达之间的关系Table3 The relationship between RCAS1/EBAG9 and P53 protein expressions in ICC tissue

2.4 RCAS1/EBAG9及P53蛋白表达与ICC术后生存时间的关系

41例患者中位总生存时间为29.7个月。RCAS1/EBAG9阳性与阴性表达的患者中位总生存时间分别为23.6、43.8个月，P53阳性与阴性表达的患者中位总生存时间分别为19.2、34.4个月。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线及生存曲线Logrank检验结果显示，RCAS1/EBAG9阳性与阴性表达的患者术后总生存时间之间的差别有统计学意义（χ2=3.862，P=0.049），RCAS1/EBAG9阴性表达患者术后生存期延长，同样，P53阴性表达患者术后生存期延长（χ2=4.977，P=0.026）（图2）。

采用单因素Cox回归分析表明，病理分级、TNM分期、淋巴结转移、侵犯肝外组织以及RCAS1/EBAG9与P53蛋白表达均可预测ICC患者预后（均P＜0.05）（表4）；采用多因素Cox回归分析表明，病理分级、淋巴结转移、侵犯肝外组织以及RCAS1/EBAG9蛋白表达是ICC患者预后的独立影响因素（均P＜0.05）（表5）。

图2 ICC患者生存曲线图Figure2 Survival curves of the ICC patients

表4 41例ICC患者病理资料单因素Cox回归分析Table4 Univariate Cox analysis of the clinicopathologic data of the 41 ICC patients

表5 多因素Cox回归模型分析结果Table5 Results of multivariate Cox regression model analysis

3 讨 论

RCAS1/EBAG9是Sonoda等[8-9,11]在1996年发现一种新的肿瘤抗原，它是通过CPG（CPG是由CPG二核苷酸序列聚集而成）基因组合克隆出来，肿瘤细胞是通过对RCAS1/EBAG9的表达来逃避免疫攻击，从而诱导阳性受体免疫细胞凋亡[12]。最新研究表明，RCAS1/EBAG9在多种肿瘤细胞膜上呈高表达[13-16]，Enjoji等[17]发现，胆管腺癌和胆囊癌中均有RCAS1高表达，Suzuoki等[18]研究发现，RCAS1在肝外胆管癌高表达是一个独立的不良预后因素，而在正常胆道上皮细胞中没有表达。本研究也发现，在ICC组织中检测到了RCAS1/EBAG9蛋白高表达，而在正常胆管组织无表达，提示了RCAS1/EBAG9蛋白可能是ICC肿瘤标志物之一，这对ICC早发现早诊断早治疗具有临床指导意义，也为早期外科手术提供机遇。

Aoki等[19]发现在肝非癌组织RCAS1/EBAG9低表达，而高表达与肿瘤低分化程度和增殖活性升高相关；在甲状腺癌中，RCAS1/EBAG9可能参与甲状腺癌的侵袭转移[20]。已有大量相关的研究表明，RCAS1/EBAG9 在膀胱癌[15]、非小细胞肺癌[21]与胆囊癌[22]中高表达，并且与肿瘤临床分期、分化程度、预后明显相关。在本研究也发现，RCAS1/EBAG9高表达与ICC肿瘤体积大、低分化、进展期以及淋巴结转移相关，阴性表达的患者术后总生存时间延长；经过单因素与多因素Cox回归分析表明，低分化、肝外侵犯、淋巴结转移与RCAS1/EBAG9阳性表达等因素是ICC独立消极预后影响因素，推测RCAS1/EBAG9参与了肿瘤进展及转移，是独立的消极预后因素，可作为判断ICC进展与预后的一项重要指标。

人类恶性肿瘤中多数存在P53突变[23]，P53基因突变可导致缺陷DNA大量复制，甚至导致恶变[24]。Meng等[25]发现，胆管癌患者中P53蛋白高表达，笔者[26]前期研究发现，肝外胆管癌患者P53蛋白阳性表达率为45.2%（19/42），并且低分化、淋巴结及远处转移患者表达升高，阴性表达患者术后总生存时间延长，结合前期研究，P53蛋白也是肝内外胆管癌进展与预后的一项重要指标。

目前更精确的RCAS1/EBAG9的细胞学活性和生物化学活性尚不清楚。Wu等[27]实验表明，P53表达可能干扰RCAS1/EBAG9表达，通过P53敲低RCAS1/EBAG9表达可显著降低结直肠癌细胞系HT-29体外增殖能力，RCAS1/EBAG9在体内可能是P53的靶基因。本研究结果显示ICC组织中RCAS1/EBAG9蛋白与P53蛋白表达正相关性，联合检测RCAS1/EBAG9与P53，可提高ICC诊治水平，为判断ICC进展与预后提供新思路。

综上所述，本研究中RCAS1/EBAG9与P53在ICC组织中表达增加,可能是ICC肿瘤标志物，并且与患者不良临床病理特征及预后密切相关，可作为预测ICC患者预后因子，可望作为生物学治疗的作用靶点。联合检测ICC的RCAS1/EBAG9与P53，可为早发现早诊断早治疗提供依据。但RCAS1/EBAG9和P53蛋白更精确的作用机制尚有待更进一步探索。