基于正交试验的风湿宁胶囊提取纯化工艺研究

刘 培，叶 花，董晨虹，王鹏飞，王 科，段秀俊

（山西中医药大学，山西晋中030619）

风湿病是一组侵犯关节、骨骼、肌肉、血管及有关软组织或结缔组织为主的疾病，其中多数为自身免疫性疾病，临床上主要表现为慢性、进行性、对称性病理改变。可能与环境、感染和遗传等因素有关，但其疾病机制尚未完全明确，其发病多较隐蔽而缓慢，病程较长，且大多具有遗传倾向，诊断及治疗均有一定难度。中医药在治疗风湿病方面有很大优势，近年来，初步阐明了很多中药的有效成分和作用机制，不断涌现出新的治疗药物，在改善患者生活质量、缓解疼痛、减少致残率、减轻药物副作用方面有重要的临床价值和现实意义［1-2］。

风湿宁胶囊为山西省中西医结合医院院内制剂，由羌活、独活、青风藤、威灵仙、片姜黄、防风、川芎、麻黄、肉桂、三棱、血竭、延胡索、川牛膝、熟地黄、砂仁、生姜和甘草17味中药组成，主要用于治疗风寒湿邪痹阻经络所致类风湿性及风湿性关节炎等。本课题属国家科技部重大专项重大新药创制项目，前期课题组已经对风湿宁胶囊对风寒湿痹型类风湿性关节炎［3-7］、胶原诱导关节炎［8-10］的抗炎作用及机制做了大量研究，同时课题组对风湿宁胶囊的质量标准做了研究，建立了独活、青风藤、血竭及肉桂的薄层鉴别方法以及青风藤及血竭含量的测定方法［11］。风湿宁胶囊中除血竭外的16味药水煎液均具有不同程度的抗炎、镇痛或免疫抑制等与治疗风湿性关节炎相应的药理活性［12-17］，故16味药的提取方法选择了水煎煮，含挥发性成分的药材先采用水蒸汽蒸馏法收集挥发油［18］，血竭粉碎入药。为减少服用量，工艺纯化选择了醇沉淀法。采用正交试验法对风湿宁胶囊的水提醇沉工艺条件进行优选，现将研究结果报道如下。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器

Dionex高效液相色谱仪，PDA-100 Photodiode Array Detector检测器，ASI-100Automated Sample Injector，Chromeleon 6 色谱工作站，DiamonsilC18（2）（150 mm×4.6 mm，5 μm） 色谱柱；METTLER TOLEDO AB135-S型十万分之一天平，HANPING FA2104型万分之一电子天平；SB-5200 DTDN超声波清洗器（宁波新艺生物科技股份有限公司），容量瓶，锥形瓶。

1.2 药材与试剂

青风藤为防己科植物青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et Wils.的干燥藤茎，羌活为伞形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang的干燥根茎及根，独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根，川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，威灵仙为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck的干燥根茎及根，防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata Schischk.的干燥根等，以上药材均由山西中医药大学裴香萍副教授鉴定为正品。青藤碱（批号0774-200206，供含量测定用）化学对照品购自中国药品生物制品检定所。色谱测定用甲醇为色谱纯，水为纯净水，其他所用试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 青藤碱的含量测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：DiamonsilC18（2）柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.1%三乙胺（35∶65）；检测波长 262 nm；柱温 30 ℃［11］。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的对照品青藤碱，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，摇匀，0.45 μm的滤膜滤过，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取提取物干浸膏粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%的甲醇溶液20 mL，超声处理20 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 测定法 分别精密吸取上述两种溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。色谱图见图1。

图1 风湿宁胶囊青藤碱测定液相色谱图

2.2 工艺条件考察［19-22］

2.2.1 提取工艺条件考察 选择青藤碱作为考察对象，以青藤碱转移率为考核指标，选择加水量、煎煮时间以及煎煮次数作为考察因素，每个因素选择了3个水平（因素水平设定见表1），采用L9（34）正交表安排实验。

表1 提取工艺考察因素水平表

2.2.2 纯化工艺条件考察 按处方比例称取各药适量，按上述最佳煎煮工艺条件，加水煎煮，合并煎液，平均分成9份，仍以青藤碱转移率作为考察指标，对影响醇沉效果的3个主要因素药液的浓缩程度、醇沉浓度以及醇沉时间进行考察，每因素设定3水平（因素水平设定见表2），仍采用L9（34）正交表安排实验。

表2 纯化工艺考察因素水平表

3 结果与分析

3.1 提取工艺条件的优选结果与分析

按处方比例称取各药味适量，共9份，按照正交表设定的试验条件分别进行煎煮，将所得煎液浓缩至稠膏，烘干。测定干膏中青藤碱的含量，计算转移率，结果见表3、表4。

从统计分析结果看，A为不显著因素，Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅲ；B为不显著因素，Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅲ；C为显著性因素，且Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅰ。即A2B2C2为最佳方案，而从实际试验结果看A2B3C2应为最佳方案。将两种方案各重复试验3次，从试验结果看两者差异无统计学意义，故从省时节能的角度选择A2B2C2为最佳方案。

表3 提取工艺考察正交试验结果

表4 提取工艺考察方差分析结果

3.2 纯化工艺条件的优选结果与分析

将所得药液回收乙醇，浓缩至稠膏，烘干。测定各干膏中青藤碱的含量，计算转移率，结果见表5、表 6。

表5 纯化正交试验结果

表6 纯化方差分析结果

从统计分析结果看，A为显著因素，Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ；B为不显著因素，Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ；C为不显著因素，Ⅰ＞Ⅲ＞Ⅱ，即A3B1C1为最佳组合。实际试验结果也是A3B1C1为最佳组合。故选择A3B1C1为最佳方案。

4 讨论

研究结果表明，水煎煮最佳工艺条件为加水量10倍，煎煮时间为1 h，煎煮次数为2次，青藤碱转移率约65%；醇沉淀最佳工艺条件为浓缩至1∶1.1，醇沉浓度为60%，时间为12 h，青藤碱转移率约63%，中试验结果表明，优选的工艺条件基本合理。

曾考虑采用多指标手段对工艺条件进行筛选，初步考虑以羌活与防风中所含紫花前胡苷、威灵仙中所含常春藤皂苷元及青风藤中所含青藤碱的综合转移率优选最佳工艺条件，这样可以兼顾各类成分的提取率。但由于本处方药味多，实验中除青藤碱外，紫花前胡苷与常春藤皂苷元均难以排除干扰，故选择青藤碱作为工艺考察指标。

水提醇沉淀的工艺路线是通过药效试验结果确定的，其抗炎止痛效果较优。本实验结果为风湿宁胶囊的制剂开发应用提供了实验依据。