清肝化痰活血方对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的防治作用*

侯艺鑫 李玉鑫 杨 雪 杨志云 江宇泳 王宪波

首都医科大学附属北京地坛医院中西医结合二科 (北京， 100015)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指酒精性因素以外多病因引起的以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为主要特征的临床病理综合征。其包括了单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及相关的肝硬化、肝癌等[1]。目前NAFLD的发病机制尚不清楚，但脂质代谢异常是NAFLD发病机制中最基础、最关键的环节之一[2，3]。肝X受体(LXR) /脂肪酸合成酶(FAS) 通路是调控肝细胞脂肪代谢平衡的重要通路之一，通过对肝细胞的脂肪代谢平衡的影响，导致肝细胞脂质沉积[4]。因此，调控LXRa、FASmRNA基因表达，可能是有效防治NAFLD 的途径之一。本课题组前期临床研究发现清肝化痰活血方能够有效降低NASH患者的甘油三酯及胆固醇水平，改善肝脏脂肪沉积。本实验通过观察清肝化痰活血方对NASH大鼠肝细胞LXRa、FAS基因表达的影响，探讨该方防治大鼠NASH的分子机制，为临床防治该病提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠70只，体量140～160g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号:SCXK(京)2007-0001] 。饲养在首都医科大学SPF 级动物房。

1.2 药物 清肝化痰活血方(茵陈蒿18g,茯苓、决明子、丹参各15g,栀子、陈皮、半夏、郁金各10g,大黄6g)。

1.3 造模与分组 70只大鼠正常喂养1周后随机分组，正常组(20只)大鼠以普通饲料喂养，自由饮水；模型组(30只)和预防组(20只)大鼠予高脂饲料(即基础饲料+100g·L-1猪油+20g·L-1胆固醇)喂养；自由饮水。造模8周，模型制备成功后，随机取预防组、模型组及正常组大鼠各10只，获取血清及肝组织标本。再将模型组剩余的20只大鼠随机分为2组，即模型组(10只)与治疗组(10只)。至此实验大鼠共分为4组，即正常组(10只)、模型组(10只)、治疗组(10只)、预防组(10只)。

1.4 给药方法 预防组大鼠自造模之日起开始灌胃清肝化痰活血方汤剂1次/d，共12周；治疗组大鼠在造模结束时开始灌胃该中药，1次/d，共4周，用量均为0.19 g/kg体质量，用药量相当于60kg成人剂量的10倍。模型组和正常组大鼠以等容积生理盐水灌胃4周。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 检测大鼠肝湿重、体重、肝指数 观察大鼠肝脏形态包括重量、外形、色泽、质地，计算肝重指数( 肝重指数= 肝脏湿重/体重×100%) 。

1.5.2 检测血清生化指标 大鼠经腹腔麻醉后，立刻从腹主动脉取血，静置30min，3000r/min离心3min，保留血清，采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清ALT、AST、TC、TG含量。

1.5.3 肝组织病理检测 8 周造模结束、4周治疗结束时，每组取10只大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，采集右叶1.5cm×1cm×0.5cm肝组织，经磷酸缓冲福尔马林溶液固定,石蜡切片,进行苏木精-伊红染色，观察大鼠肝组织病理情况。

1.5.4 大鼠肝细胞LXRa和FASmRNA测定 肝细胞RNA 的提取和逆转录反应:TRIzol 提取肝细胞RNA，测定含量并计算浓度，采用Oligo(dT) 逆转录法，将RNA 逆转录为cDNA。引物设计与合成:据Genebank提供LXRa( NM-031627.2)、FAS (NM-1 39194.2)、ACTIN (NM-031144) 基因序列，以大鼠ACTIN作为内参基因，引物由武汉塞维尔生物科技有限公司设计并合成(见表1)。反应体系:2.5×Real Master Mix/20×SYBRsolution 9ul，上、下游引物各2ul，DNA 模板1ul，加灭菌双蒸水补至总体积20μL。反应条件:①95℃持续1 min预变性；② 95 ℃持续10s变性； ③GAPDH 60℃，LXRa60℃，FAS60℃，退火20 s；④ 68 ℃持续30 s 延伸，②～④ 39个循环；⑤溶解曲线分析， 72～95 ℃，持续5～10 s。反应完毕，采用Opticon Monitor3.1 软件分析，用公式2-△△Ct方法进行相对定量。

表1 引物序列

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 70只大鼠均无死亡，其中正常组大鼠饮食正常，毛发有光泽，活泼爱动；模型组大鼠体型肥胖，嗜睡懒动，毛发油腻欠光泽；预防组和治疗组大鼠饮食减少，活动量均有不同程度下降，毛发欠光泽。

2．2 各组大鼠两时段肝湿重、体重、肝指数情况 见表2

表2 各组大鼠两时段肝湿重、体重、肝指数比较

与正常组同时段比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组同时段比较,△P<0.05，△△P<0.01

2.3 各组大鼠肝脏病理变化

2.3.1 肉眼观察肝组织 正常组大鼠肝脏形态正常,肝脏为红褐色,表面光滑有光泽,实验结束时无1例出现异常；模型组大鼠肝脏体积明显增大,重量明显增加,切面油腻,边缘钝,表面粗糙呈现黄褐色；预防组大鼠肝脏比正常组的增大,肝脏重量增加,但比模型组的体积小，肝脏呈较淡黄褐色,但表面光滑；治疗组大鼠肝脏体积比正常组的增大,呈现砖红色,

表面光滑,但比模型组大鼠肝脏体积偏小。

2.3.2 肝脏HE染色结果 4周治疗结束时，正常组大鼠肝小叶轮廓清晰、完整，肝索排列有序，肝细胞呈放射状围绕在中央静脉周围，肝细胞无脂肪变性，细胞核位于肝细胞中央，核大而圆(见插页图1A),模型组大鼠的肝小叶结构被破坏，肝窦结构难以辨认，肝索排列不整齐，肝细胞呈弥漫性脂肪变性，胞浆内可见大小不等的大泡样脂滴，部分融合为大脂滴，与周围边界不清晰，还可见到肝细胞有点状坏死，碎霄样坏死和炎性细胞(见插页图1B)；预防组大鼠肝小叶结构完整，脂肪变性细胞数目较模型组明显减少，仅见少数细小脂滴散布于肝细胞内，肝索结构排列整齐(见插页图1C)；治疗组大鼠肝小叶结构尚清晰，肝细胞的脂肪变性数目亦明显减少，胞浆内脂滴数目减少，偶见个别大脂滴存在(见插页图1D)。

图1 各组大鼠肝组织病理图（HE，×200）

2.4 各组大鼠两时段肝细胞LXRa、FASmRNA表达情况 见表3。

表3 各组大鼠两时段肝细胞LXRa、FASmRNA表达比较

与正常组同时段比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组同时段比较,△P<0.05，△△P<0.01

2.5 各组大鼠血清生化指标检测结果 见表4。

表4 各组大鼠两时段血清各生化指标比较

与正常组同时段比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组同时段比较,△P<0.05，△△P<0.01

3 讨论

肝脏脂肪沉积是NASH的最典型的病理特征。各种原因导致的肝脏脂质代谢紊乱和肝细胞内异常脂肪沉积；而异常的脂肪沉积又会是代谢紊乱的启动因素，从而加重肝细胞内脂质代谢紊乱和肝细胞内脂肪沉积[5]。

肝细胞脂质代谢的平衡受到多条信号通路的共同调控和影响，目前针对核受体对肝细胞内脂质平衡机制的研究越来越多[6]。本实验研究了核受体LXRa与靶基因FAS结合通过调节肝细胞脂肪酸的生成，从而影响脂肪的合成，进而导致脂肪肝的形成。LXRa是脂肪酸生成的关建基因，FAS是LXRa的下游基因，是脂肪合成的关键酶，其中LXRa对于FAS的调节，一方面是直接与FAS启动子结合，另一方面是间接通过SREBP-1C途径从而上调FAS基因表达来实现的[7]。SREBP-1C的过度表达增加FAS基因转录，从而增强FAS基因活性，引起脂肪酸合成增多，进而导致肝细胞内异常脂肪沉积形成脂肪肝[8]。在缺失LXR基因的小鼠体内，肝细胞内SREBP-1C的mRNA基因表达水平显著下降，而FASmRNA水平显著下降[5]。本研究结果表明，模型组较正常组大鼠肝细胞LXRa、FAS基因表达水平均明显升高(P<0.01),本结果与既往研究结果一致，表明LXRa、FAS基因调控了肝细胞内脂质代谢紊乱。

从中医角度来看，NASH属于“积聚、胁痛、痰湿”等范畴,病位在肝,涉及脾胃。病因或过度肥胖,或感受湿热疫毒,或过食肥甘厚味，或情致失调等。肝失疏泄,湿热内蕴，脾失健运,瘀血阻滞,痰浊内结,最终形成湿热痰瘀相互胶结,痹阻于肝脏脉络是NHSH病机演变的基本规律[9]。文献报告表明针对单纯性脂肪肝的患者，只要注意控制饮食，加强锻炼，就能收到很好的临床效果,而对于NASH的患者(如血清转氨酶升高以及肝活检有炎症改变)则需要采用药物，如用清热利湿，化痰活血的药物。清肝化痰活血方是地坛医院中西医结合中心临床用于治疗NASH的基本方剂,由茵陈蒿汤合二陈汤加减化载组成，具有清热利湿活血化瘀功效。本次实验结果提示该方可有效地防止肥胖、防止肝内脂肪大量沉积，而且具有逆转脂肪沉积的作用，对已经发生脂肪变的肝脏有缓解作用。ALT和AST,是非特异性细胞内功能酶,正常时血清内含量很低，只有当肝细胞受损时,肝细胞膜通透性增加,导致其活性迅速增加，是迄今为止被认为反映肝细胞损害的重要指标。NASH患者转氨酶升高常以AST升高为主，且升高幅度不太显著[10]。本实验结果说明清肝化痰活血方对NASH有很好地保肝抗炎降酶作用，同时该方能够调节LXRa/FAS信号通路，减少脂肪合成与沉积，达到改善NASH大鼠肝脏病理情况，使肝细胞脂质代谢紊乱趋于正常。

清肝化痰活血方对NASH有较好的临床治疗作用，可在一定程度上防止肥胖、防止肝脏脂肪过度沉积、改善肝功能、改善肝细胞脂肪变性、减轻肝组织炎症、调节LXRa/FAS 信号通路，减少肝脏脂肪沉积，此方可在临床推广运用。