复制蛋白A1和A2在肝细胞癌患者癌组织中的表达及临床意义*

王肖泽 田学军 蒙 轩

1.清华大学玉泉医院普外科 (北京， 100040) 2.中国人民解放军总医院肝胆外科

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，占癌症死亡的第二位，在我国原发性肝癌的发病率较高，给医疗资源及患者生活带来较大负担[1]。原发性肝癌根据病理组织来源，常规可分为3类肝内胆管癌、混合性肝癌以及肝细胞癌，其中超过90.51%的患者为肝细胞癌[2,3]。虽然原发性肝癌的临床诊治技术和相关研究均取得了较大进步，但仍有大量患者因为病情反复或治疗无效而死亡。随着分子疾病学的不断发展，众多学者开始将基础疾病的发病机制与人体细胞通道或蛋白分泌通道相联系。有研究发现，肝细胞癌的产生与人体“三多因素(多蛋白、多基因、多步骤)”有关[4]，其中复制蛋白A(RPA)是在DNA代谢过程中发挥重要作用的主要真核细胞结合蛋白(单链DNA)，但是RPA各亚单位如何具体影响疾病发生和进展，仍需进一步研究[5～7]。本研究探讨RPA在肝细胞癌患者癌组织中的表达及临床意义，现将结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 随机选取2018年1月至2018年6月期间，在我院治疗的肝细胞癌患者60例。纳入标准：患者经病理证实为肝细胞肝癌；暂时未接受过任何治疗；肝功能Child-Pugh A级或B级；暂无其他部位转移；无重要器官损害；患者均签署知情同意书。排除标准：患有其他恶性肿瘤(或其他类型肝癌)者；存在明显凝血功能障碍者；患有其他疾病，病情危重而不宜手术者；精神或意识不正常，无法配合正常手术的患者。另有30例肝脏良性肿瘤手术患者作为对照组，在术中留取肝组织待测。

1.2 检测项目及方法 ①采集患者入院初基本情况包括性别、肝癌细胞分化程度、TNM分期、乙肝病毒表面抗原、淋巴结转移及门脉癌栓等情况。②比较不同预后患者治疗前后RPA1、RPA2表达含量，根据改良实体瘤疗效评价标准(CIST)进行预后评估，分为完全缓解、部分缓解、疾病稳定、疾病进展。③RPA1、RPA2含量检测：组织穿刺或术中留取组织来取得标本，包括癌组织或正常组织，当即用生理盐水洗净后放入冻存管(提前放入去RNA酶)中进行低温保存。采用Western blotting方法进行检测，取样品中80.0mg组织，提取蛋白，按照BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所)说明书进行操作，最后利用SDS-PAGE电泳进行转模、封闭及显色。取出条带晾干，照相。将胶片进行扫描(或高清拍照)，测定目的条带的灰度值，用以表示RPA1、RPA2的含量。

2 结果

2.1 两组患者RPA1和RPA2表达情况 见表1。

2.2 不同情况肝细胞癌患者RPA1表达情况 见表2。

2.3 不同情况肝细胞癌患者RPA2表达情况 见表3。

2.4 不同预后的肝细胞癌患者RPA1和RPA2表达情况 见表4。

表1 肝癌患者与健康人群RPA1、RPA2表达比较

表2 不同情况肝细胞癌患者RPA1表达水平比较

与TNMⅠ期比较，*P<0.05；与有淋巴结转移比较，△P<0.5

表3 不同情况肝细胞癌患者RPA2表达水平比较

与低分化比较，#P<0.01；与TNMⅠ期比较，*P<0.05；与有门脉癌栓比较，★P<0.05

表4 不同预后的肝细胞癌患者RPA1、RPA2表达水平比较

3 讨论

肝细胞癌的发生、发展、以及转移，与细胞的损伤修复过程密切相关，多位学者提出，人体的多种抑癌基因(P53、APC、Rb)和原癌基因都参与其中[8～10]。在DNA延长和复制起始阶段，RPA蛋白发挥着关键作用，也有研究发现[11,12]，在DNA的损伤修复阶段RPA也起着重要作用。因此，基因组的不稳定与肿瘤的发生有着密切关系，而在肝细胞癌发展过程中肿瘤细胞的异常生长需要DNA的大量复制和充足的修复能力[13,14]，所以，我们可以推断RPA1、RPA2参与了肝癌的形成。本研究分析RPA1、RPA2在肝细胞癌和肝脏良性肿瘤患者肝癌组织中的表达情况，结果表明肝细胞癌患者RPA1和RPA2的表达高于肝脏良性肿瘤患者，且前者的高表达与患者的性别、HBV感染，有无淋巴结转移等无关，而与癌细胞分化程度、TNM分期、门脉癌栓存在一定关联。肝癌细胞分化程度越高、肿瘤分期为Ⅲ、Ⅳ期以及有门脉癌栓的患者肝癌组织中RPA1、RPA2表达更高，提示肝细胞癌患者病情越严重，其RPA1、RPA2表达水平相对越高。近年来有研究证实，RPA(特别是RPA2)能够与P53抑癌基因相互作用，导致野生型P53抑癌基因的活性下降，使得受损的DNA通过细胞周期的检测，肿瘤细胞更容易形成[15～18]。同时，RPA可以直接影响到碱基切除修复、核苷酸切除修复、双链断裂修复三个主要过程，进而影响到肿瘤细胞异常生长时DNA三大过程(复制、修复、凋亡)，还可影响到肿瘤细胞的生理活性及疾病的病理特征。因此，我们认为RPA1、RPA2的高表达能够作为判断肝细胞癌恶性程度及患者预后的重要参考指标。对这两个特异性蛋白表达水平进行实时监测，有助于了解患者病情，并预测其发展[19～21]。有研究显示，肝细胞癌患者体内TNF-α、甲胎蛋白等炎性因子均会有显著上升，而miR-590-5p和miR-590-3p等基因表达也有明显增加，至于RPA1、RPA2水平与上述指标是否存在联系，仍需进行深入研究。

随着医疗水平的发展，肝细胞癌的治疗方法逐渐增多，包括手术、局部消融、介入治疗、放疗、药物治疗等，术后总生存率也有所提高，但最新的研究结果显示，肝癌仍是预后最差的一种肿瘤[22～24]。本研究结果显示，预后不乐观的患者肝癌组织中RPA1、RPA2表达水平显著高于预后完全缓解的患者，由此，也可以将RPA1、RPA2水平作为判断肝癌患者预后缓解的一个指标。从另外一个角度来说，我们可以尝试通过分子靶向治疗技术，对肝细胞癌患者的临床治疗进行新的尝试。分子靶向治疗是近些年迅速发展的一种肿瘤治疗方式，其作用机理为利用肿瘤细胞与健康细胞间的分子生物学差异，采用一系列措施靶向性地抑制肿瘤细胞生长，加速肿瘤细胞死亡[25]。有研究表明RPA可能是细胞毒性药物的靶点，本研究的结果也证实RPA的表达与癌组织间有着密切关系，但由于本研究所纳入的病例数有限，并不能得出确切结论，RPA1、RPA2表达水平能否作为肝细胞癌恶性程度评估的重要指标仍需进一步深入研究。