乳酸菌去除脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究进展

■吴宛芹 曲 睿 艾重阳 刘冠闻 师俊玲 蒋春美

(西北工业大学生命学院，陕西西安710072)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON），又称呕吐毒素，是禾谷镰刀菌产生的一类真菌毒素，易引起肠道病变，改变肠道屏障[1]，产生免疫毒性[2]，严重威胁着人类和动物的健康。DON 广泛存在于食品和饲料中[3-5]，尤其是小麦、玉米和燕麦等受镰刀菌侵染的籽粒中含量较高。DON 具有较强的抗加工和抗加热能力[6]，难以彻底清除，对食品和农业造成严重的经济损失。DON的环氧基团是其主要的毒性作用位点[7]（图1），此外，C3 上的羟基在毒性方面也起着重要的作用，均可作为降解DON的作用位点。

图1 DON结构图

目前，关于去除DON 的方法主要有物理、化学和生物降解法，其中物理和化学降解方法主要包括紫外线照射[8]、氩等离子体[9]和臭氧处理[10]。臭氧处理虽对小麦和面粉的质量没有负面影响[11]，但需要特殊的加工设备且费用昂贵，会对环境产生不利影响。生物脱毒特异性强、效率高，且是环境友好型，并可用于不同食品加工阶段，具有其他方法不能比拟的优势而被广泛应用[12-13]。生物法主要通过微生物和酶解等方法去除DON。目前已报道许多细菌和酶能降解DON，但这些细菌或酶类能否直接应用于饲料及其他谷物等食品加工过程中还有待进一步研究。Doll 等[14]发现市售降解DON 的产品解毒效果不明显，因此寻找有效的脱毒产品迫在眉睫。乳酸菌因其益生作用且不会影响产品的质量，已成为去除DON的研究热点。

乳酸菌（Lactobacillus）是食品中常见的益生菌[15]，根据遗传学上的差异，可以分为杆菌、梭菌、柔膜菌[16]。其中杆菌包括6个科，分别是球藻科、肉杆菌科、肠杆菌科、乳杆菌科、明串珠菌科和链球菌科[17]。乳酸菌能调节全身免疫应答[18-19]、抗炎[20]、预防宫颈癌[15]、缓解脑部疾病[21]、维持肠道微生物菌落平衡[20，22]、改善小鼠便秘[23]和减轻重金属中毒症状[24]，提高机体抵抗力[25]。现已报道乳酸菌对不同真菌毒素均有去除作用，如去除黄曲霉毒素[26-29]、展青霉素[30]，并能显著去除DON。

本文主要针对乳酸菌及其他细菌对DON的去除作用进行综述，通过对其他细菌降解酶的分析，推测乳酸菌降解DON 的可能性及普遍性，展望了在饲料中添加乳酸菌去除DON的应用潜力。

1 去除DON的乳酸菌种类

目前已报道的能去除DON 的乳酸菌共有14 种（表1），主要为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbruekii）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei）、乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、黄乳杆菌（Lactobacillus jugurti）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei），它们主要来源于食品和食品原料。其中，以植物乳杆菌、德氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的去除效率较高，为55%左右，其他乳酸菌的DON 去除率较低（13%～40%），这可能是因为不同菌株之间细胞壁成分的差异导致的。

2 乳酸菌去除DON的机制

2.1 生物吸附

微生物去除真菌毒素的方式主要包括生物吸附和酶解作用。目前已有报道的乳酸菌去除真菌毒素的机制多为生物吸附，作用机制为乳酸菌细胞壁上的肽聚糖和胞外多糖结合真菌毒素，形成可逆的复合物，从而去除真菌毒素。乳酸菌对DON 的去除方式包括吸附和降解作用，其中以生物吸附作用最为常见（表1）。El-Nezami 等[31]研究了鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG）对DON的去除作用，发现活菌和灭活的菌株在去除DON 能力上没有显著差异，且未发现新物质生成，表明Lactobacillus rhamnosus GG通过吸附作用去除DON。Niderkorn 等[32]发现鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、布氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、黄乳杆菌、乳酸乳杆菌、干酪乳酸杆菌等多株乳酸菌均通过吸附作用去除DON，其中，植物乳杆菌和德氏乳杆菌去除能力最强，去除率高达55%。Franco等[35]利用高效液相色谱法分别对植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、类干酪乳杆菌的去除DON能力进行定量分析，发现这些菌株均能降低DON 的含量，但未观察到新物质生成。Zou 等[36]研究了乳酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳酸杆菌、植物乳杆菌对DON的去除机制，结果表明，去除方式为物理结合而非生物转化。Hassan等[37]发现热灭活的清酒乳杆菌能够显著降低培养基中DON含量。

表1 乳酸菌对DON的去除作用及其DON降解酶

2.2 生物降解

目前已报道的能够降解DON的微生物主要包括细菌和真菌。生物降解DON主要是通过破坏环氧基团或改变C3结构，降解产物多为低毒甚至无毒的脱氧化DON（DOM-1）、3-epi-DON、3-酮-DON。一般认为，细菌是通过降解酶将DON降解为低毒或者无毒的产物，称为酶解过程。但也有关于DON的降解研究，只鉴定出降解产物，并未阐明产生生物降解作用的物质（酶或者其他物质），其生物降解的机制尚不明晰。

2.2.1 酶解

已报道的具有降解DON能力的酶类共有6种，以醛酮还原酶为主。Karlovsky[38]通过对DON 分子结构分析，预测C3位上的差向异构反应（从DON到3-epi-DON）具有常见性，该反应可能需要两种酶参与，对比DON 及其产物结构确定该反应过程具有不可逆性。Hassan 等[39]证实了这种猜想，通过将合成的3-酮-DON 和DON 分别作为底物与德沃斯氏菌属（Devosia mutans）反应，检测反应产物，发现从DON 到3-酮-DON 和3-酮-DON 到3-epi-DON 由两种不同的酶诱导，DON到3-epi-DON 在热力学上更容易实现，解释了该差向异构反应的不可逆性。3-epi-DON可能通过形成分子内氢键，破坏环氧基团，从而使其毒性降低。

由表2 可知，Carere 等从德沃斯氏菌属（Devosia mutans 17-2-E-8）中分离出两种能将DON转化为3-epi-DON 的蛋白酶[40-41]，其中，将催化DON 到3-酮-DON的蛋白命名为DepA酶，催化3-酮-DON转化为3-epi-DON 的蛋白命名为DepB 酶（图2）。DepA 酶是PQQ依赖酶，在不存在PQQ情况下，该酶不能催化DON形成3-酮-DON。对DepB酶结构进行分析，发现该酶属于醛酮还原酶（AKR家族），具有NADPH依赖性，热稳定性中等，且易于冻干，有较宽的pH作用范围。

He等[42]从麦田中分离出一株能将DON降解为3-epi-DON 的菌株Sphingomonas S3-4 菌株，并通过基因组序列分析比较，得到了能够将DON降解为3-酮-DON 的酶AKR18A1，将重组的AKR18A1 蛋白在大肠杆菌中表达，发现该酶催化DON 的反应在一定的温度和pH 范围内是可逆的，在该酶存在下，加入NADP+，DON 可转化为3-酮-DON，而在NADH 存在下，该酶将3-酮-DON转化为DON。

表2 DON降解酶及其降解产物

图2 酶降解DON示意图

除了差向异构酶以外，国内外的研究学者还发现了支持其他反应的酶。Ito 等[43]发现了一种细胞色素P450系统能够分解代谢DON。研究人员从湖水中分离出一种新菌株KSM1，通过基因组文库筛选获得P450基因ddnA，体外重组获得一个电子传递链，将该酶系对DON 的作用原理进行表征，发现产物为16-HDON。通过小麦幼苗测定发现该氢化作用显著降低了DON对小麦的毒性。

国内研究者也从其他真菌中找到能够降解DON的酶，杨俊[44]利用和毒素含有相同的环氧基团的苯基环氧乙烷，通过环氧基团类似物对土壤中菌群进行筛选，筛选出一种能够产生降解苯基环氧乙烷的菌株黑曲霉F1，从该菌株中提取出一种脂肪酶，并进一步证明该酶能够降解DON 产生新的物质。王开萍[45]利用同样的方法对土壤中菌群进行筛选，筛选出一株米曲霉As-w6，并对菌株所产生的降解酶进行纯化鉴定，发现该酶属于脂肪酶，且该酶在40 ℃以下和pH 值6～8 之间具有较好的稳定性，能够降解DON 产生新的物质。

目前，尚无明确的研究表明乳酸菌中存在降解DON 的酶类。但Garcia 等[34]发现在鼠李糖乳杆菌RC007 无细胞上清液能降解DON，且不存在吸附作用。胡杉杉等[33]分离出一株副干酪乳杆菌，在37 ℃、pH值7时去除率最大，研究虽未分析是否存在降解产物，未比较灭活菌和活菌去除DON的差异，但根据最适反应条件推测此副干酪乳杆菌能降解DON。基于以上报道可以推测，乳酸菌中可能存在降解DON 的机制。

2.2.2 其他生物降解作用

除了上述已知可降解DON 的酶类，也有研究只鉴定了DON 降解后的降解产物，而其产生降解作用的酶类尚未阐明。

Binder等[46]、Binder等[47]和Fuchs[48-49]从瘤胃中分离出能够脱环氧化DON的菌株，其降解产物为DOM-1。多个研究在鸡肠道和土壤中[50-52]分离出的细菌能将DON 转化为DOM-1[50，53-55]。研究人员通过富集培养从土壤中获得一株能完全降解DON 的根瘤农杆菌（Agrobacterium rhizobium），其代谢产物为3-酮-DON，免疫抑制毒性显著低于DON[56]。Ikunaga等[57]从土壤中分离出第一株能降解并同化DON 的菌株，属于诺卡氏菌属（Nocardioides sp.）。德沃斯氏菌属（Devosia sp.）和Paradevosia shaoguanensis DDB001 通过作用于C3 位点降解DON[39，58-61]，降解产物为3-酮-DON 或3-epi-DON。Ito 等[43]发现新菌株Sphingomonas sp. Strain KSM1 可将DON 转化为16-HDON。上述降解产物多通过高效液相色谱和气相色谱进行鉴定，通过产物的保留时间确定产物的种类和结构（表3）。

表3 细菌对DON的降解作用及降解产物检测条件分析

3 乳酸菌可能存在的降解机制

乳酸菌对DON 的去除机制，除了吸附作用可能存在降解作用，且这种降解作用可能是普遍现象。已经发现降解DON 的酶类，醛酮还原酶和P450 酶系普遍存在于各种细胞中。但是，目前尚未报道乳酸菌中存在降解DON 的酶类。本文利用Blast 对表2 中6 种降解酶进行生物信息学分析，发现部分乳酸菌中存在与AKR18A1 和DepB 相似的蛋白，分析这两种酶所诱导的酶促反应，推测同时含有这两种相似蛋白的菌株能将DON 转化为3-epi-DON，首先AKR18A1 诱导DON 转化为3-酮-DON，随后DepB诱导3-酮-DON 转化为3-epi-DON，完成两步酶促反应。

利用NJ法对具有两种相似蛋白的菌株构建进化树（图3），发现Lactobacillus sp. 2-3、Lactobacillus paralimentarius和Lactobacillus midensis这三种菌株最有可能存在降解DON为3-epi-DON 的能力。分析系统发育进化树可知，多株乳酸菌具有降解DON 的能力，除图3 中所示菌株，鼠李糖乳杆菌已证明能降解DON，说明乳酸菌中可能存在其他降解机制，且乳酸菌可能普遍存在降解DON 的能力。利用在线软件PredictProtein 对AKR18A1 和DepB 进行分析，发现这两种蛋白均存在于细胞质中，且可催化DON 到3-epi-DON 的差向异构反应；同时，只含有AKR18A1相似蛋白的乳酸菌也能将DON 转化为毒性更低的3-酮-DON。

图3 基于AKR18A1和DepB蛋白构建的系统发育树

同时，对目前已经检测出对DON 为生物吸附作用的乳酸菌（表1）进行分析，发现部分乳酸菌也含有与AKR18A1和DepB相似的蛋白，因此推测这些菌株对DON不仅存在吸附作用，还可能存在降解作用。

4 乳酸菌去除DON的应用

已有研究表明可在饲料中添加乳酸菌降低DON毒性，增强肠道抵抗力。Garcia 等[34]利用猪空肠外植体研究鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus RC007）对DON 的去除作用，发现鼠李糖乳杆菌可有效去除DON，缓解DON引起的肠道毒性，维持肠道健康，可作为饲料添加剂降低DON 引起的肠道毒性。Wu 等[67]和段永乐[68]通过研究植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum JM113）对DON 引起的肠道毒性的保护作用，以肉鸡为研究对象，发现该菌株能减少DON对肠道屏障的损伤，增加有益菌的丰度，增强肠道的消化吸收和代谢功能。在饲料中添加乳酸菌降低DON，可以改善机体调节能力，促进代谢消化和养分利用[69]。同时乳酸菌还能降低污染小麦中镰刀菌毒素，提高小麦发芽率[70]。

5 展望

目前DON 的去除多采用DON 降解酶，或将菌株直接加入饲料或谷物中，但目前报道有效的菌株多来源于肠道或土壤中，这些菌株的安全性和有效性还有待评估。添加乳酸菌等益生菌去除DON将是未来发展的主要方向，能避免影响产品质量和对机体造成伤害，促进机体健康生长。

关于乳酸菌去除DON的机制已报道的多为吸附作用，但吸附作用往往可逆，复合物的稳定性受到很多因素的影响，菌种、处理方式以及环境因素都能导致复合物重新释放毒素，不能永久去除，存在较大风险，使得利用乳酸菌降低饲料和食品中DON 受到限制。本文通过生物信息学分析，发现乳酸菌中可能普遍存在降解DON 的机制，且已有报道鼠李糖乳杆菌能降解DON。因此，未来进一步证明乳酸菌降解DON的机制，发掘乳酸菌中的新型DON降解酶，从而推动DON生物降解的研究及其在饲料及食品行业的应用。