海南省柑橘主产区黄龙病和病毒病的发生危害情况调研初报

崔一平 彭埃天 李子力 凌金峰 宋晓兵 郭泽成 陈霞 程保平 殷瑜

摘要 柑橘是我国南方重要的水果之一，柑橘黄龙病和柑橘病毒病已经对我国柑橘的安全生产造成了严重威胁。为了解柑橘黄龙病和病毒病对海南柑橘产业的危害情况，本研究通过荧光定量PCR（Quantitative PCR）和反转录PCR（RT-PCR）分别对随机采集自海南柑橘主产区澄迈县3个福橙种植园和琼中县4个绿橙种植园共计109个样品进行了柑橘黄龙病和柑橘5种主要病毒病的检测。结果表明：澄迈县福橙标准化种植示范基地和琼中县营根镇绿橙种植园2个新植橘园的柑橘黄龙病发病较轻，检出率仅为8%和11%，而其他5个橘园的柑橘黄龙病检出率均在75%以上，严重的达100%。除此之外，7个橘园均未检测到柑橘褪绿矮缩病毒;澄迈县和琼中县的衰退病毒病检出率分别在52.9%和77.8%以上，黄脉病毒病在83.3%和90%以上。澄迈县还检测到碎叶病毒病的存在，检出率在38.1%以上，除红湖农场外还存在裂皮病毒病，检出率在11.8%以上。琼中县的绿橙种植园3还存在裂皮病毒病，检出率为43.8%。综上所述，柑橘黄龙病和病毒病已经严重威胁到海南省福橙和绿橙主产区的柑橘生产安全。加强对海南柑橘苗木安全生产的同时，亟需采取有效的田间综合防控措施，以促进海南柑橘产业的健康发展。

关键词 柑橘黄龙病; 柑橘病毒病; 海南省; 柑橘

中图分类号： S 412

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018359

柑橘是我国南方一种重要水果，柑橘黄龙病（citrus Huanglongbing）是目前世界柑橘生产上最具有毁灭性的病害之一[1]。该病害已广泛分布于中国、印度、南非、美国和巴西等世界上50多个柑橘种植国家。我国的柑橘黄龙病主要分布在广东、广西、福建、海南、江西等主要柑橘种植区域，此外湖南、浙江、四川、云南、贵州和台湾等省市柑橘种植区域也有发生。引起我国柑橘黄龙病的病原为α变形菌纲韧皮部杆菌属亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus，（Las）[24]。该种为耐热型（28～32℃），传播媒介为柑橘木虱Diaphorina citri[5]。黄龙病菌主要通过柑橘木虱、带病苗木、嫁接等进行传播，但不能通过汁液摩擦及土壤传播;同时在柑橘树体内的繁殖扩展受到柑橘维管束的限制。目前引起柑橘黄龙病的病原菌还不能人工培养，同时也没有发现防治柑橘黄龙病的有效药剂。

柑橘黄龙病可在柑橘上形成典型症状：如叶片褪绿均匀黄化或斑驳、革质化，叶脉粗大，果实出现“红鼻子果”等。田间柑橘黄龙病发病症状有时极易与柑橘田间缺素症、病毒病及药肥害等症状相混淆，肉眼进行鉴别诊断，准确率不高，易误判。因此，利用现代科技手段，采用合适的方法对柑橘黄龙病进行准确的诊断就显得尤为重要。目前较多采用PCR（polymerase chain reaction）对柑橘黄龙病进行分子诊断[68]（http：∥www.rec.ri.cmu.edu/usda）。常见的PCR检测法有常规PCR、巢式PCR和实时荧光PCR。2014年，程保平等通过试验比较了以上3种方法检测柑橘黄龙病的灵敏度，发现荧光定量PCR方法明显优于其他2种方法，且具有操作简便、检测灵敏度高、结果数字化可读性强及可以量化等优点，是目前公认的较为准确的一种柑橘黄龙病检测方法[9]。

在田间，柑橘病毒病能够在柑橘上造成与柑橘黄龙病相类似的症状。柑橘病毒病的发生严重影响柑橘植株的生长和柑橘的品质，同时威胁柑橘的苗木安全。本文选取我国已报道过的5种病毒病（柑橘衰退病毒病、柑橘裂皮病毒病、柑橘碎叶病毒病、柑橘褪绿矮缩病毒病及柑橘黄脉病毒病）的引物，采用RT-PCR方法對来自海南的样品进行检测。其中，柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus （CTV）、柑橘裂皮病类病毒Citrus exocortis viroid（CEVd）、柑橘碎叶病毒Citrus tatter leaf virus（CTLV）是3种严重威胁柑橘生产的病毒，在世界范围内广泛分布[12];柑橘褪绿矮缩病毒Citrus chlorotic dwarf associated virus（CCDaV）为2012年Loconsole等在柑橘上鉴定出来的一种单链DNA类病毒，该病毒主要危害柠檬、葡萄柚、橘橙等柑橘品种，在我国少数地区存在[13];柑橘黄脉病毒Citrus yellow vein clearing virus（CYVCV）为陈洪明等于2015年在‘尤力克柠檬上新发现的病毒，所引起的病害为嫁接传染性病害[14]。

海南省‘绿橙和‘福橙是20世纪80年代从广东廉江引进的‘红江橙Citrus tangerine Hort. Et Tanaka×Citrus sinensis （L.） Osbeck经过多年培育而来。琼中县和澄迈县分别是海南柑橘‘绿橙、‘福橙的主产区。‘琼中绿橙是海南省的名牌产品，获国家农业部无公害农产品认证和国家绿色食品认证。2006年1月，“琼中绿橙”商标被国家商标局批准注册，是海南省第1个有地理标志证明的商标[10]。澄迈‘福橙在2008年被定为国宴果品，同年申请注册了“澄迈福橙”商标。调查表明，由于柑橘黄龙病的危害，琼中县‘绿橙的种植面积从1998年以来到2015年呈现抛物线式发展（图1）。自2006年首次在海南省发现柑橘黄龙病以来，琼中县几乎所有的柑橘产地都有发生[16]。2008年琼中县‘绿橙的种植面积达到最高点，约2 800 hm2。此后，2008年-2013年期间，柑橘种植面积锐减;至2015年-2016年，柑橘种植面积锐减为800 hm2，几乎恢复到了2002年前的水平[17]。近年来，柑橘黄龙病对海南省柑橘产业危害的报道不断出现，特别是对海南的主栽品种‘福橙和‘绿橙。过去主要是通过肉眼判别和普通PCR的方法对海南地区的柑橘黄龙病进行鉴定，本文通过Quantitative PCR和RT-PCR的方法对随机采集的海南‘福橙和‘绿橙样品进行柑橘黄龙病及柑橘病毒病的检测，同时结合相应的田间调研，对目前海南柑橘产业面临的问题进行综合分析和阐述，旨为政府部门或相关生产单位柑橘生产安全和病害综合防控提供参考，以利于海南柑橘产业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料和果园基本情况

柑橘样品采集时间分别为2017年3月、12月。采自海南‘福橙、‘绿橙的主要种植区域。

澄迈县福山镇澄迈‘福橙标准化种植示范基地： 种植当地繁育的无病种苗，2015年10月种植，种植时间约2年，共28.67 hm2，2万多株，田间管理中上水平，有水肥滴灌系统，水肥中上，长势正常，株高0.8～1.5 m，未挂果，未见黄龙病症状或黄化症状树。

澄迈县福山镇东义‘福橙种植园：2015年初种植，来自外地繁育的无病种苗，种植约3年，面积约0.8 hm2，700株左右，田间管理优良，有水肥滴灌系统，水肥充足，长势优良，枝梢生长旺盛，开花挂果优良，已是第二年桂果，株高1.5～2.5 m，个别植株生长明显变差，果实变小且可见黄龙病症状或黄化症状树。

澄迈县福山镇红湖农场‘福橙种植园：2013年10月种植，种植约5年，原种植约5 000株，因黄龙病危害目前仅剩约2 000株，田间管理中下，水肥中下，长势较差，株高1.5～2 m，开花中等，挂果不多，多见黄龙病症状或黄化症状树。

琼中县和平镇‘绿橙种植基地的3个果园：种植约为10年，由政府统一规划种植后分别由不同农户管理。果园1和果园3，黄龙病发生较为严重，且田间管理差，水肥差，果树长势差，枝梢较纤细，落叶较多，树冠较低、稀疏，株高2～3 m，开花不良，挂果极少，多见黄龙病症状或黄化症状;果园2，黄龙病发生较为严重，但逐年清除病树，田间管理中上，水肥中上，果树长势正常，株高2～3 m，开花挂果正常，株产正常，但果园仍可见黄龙病症状或黄化症状树。

琼中县营根镇‘绿橙种植园：该园为‘绿橙新植园，2017年初种植，种植约1年，田间管理中等，水肥中等，长势正常，株高约0.5～0.8 m，未挂果，未见黄龙病症状或黄化症状。

采用五点采样法随机采集109个样品。

1.2 试验方法

1.2.1 柑橘DNA和RNA的提取、检测及RNA的反转录

DNA和RNA的提取：每份DNA和RNA样品均采集2～3个柑橘叶片中脉（或者取柑橘果实）0.5 g左右，用刀片切碎，而后用液氮快速将样品磨碎，依次类推。每个样品单独用一副手套、一个研钵和研磨棒。本文中DNA的提取严格按照试剂盒说明书进行提取，试剂盒为（AXYGEN）爱思进动植物基因组DNA制备试剂盒，具体提取方法详见试剂盒说明书。RNA的提取主要采用天根生化科技有限公司的RNA提取试剂盒（货号DP441，RNAprep Pure Plant Plus Kit），具体操作详见试剂盒说明书。

DNA和RNA的检测：取2 μL样品在超微量紫外/可见分光光度计（Nano-100）仪器上进行检测，读取并记录DNA和RNA的含量和质量数值。RNA的反转录：具体操作见天根生化科技有限公司反转录试剂盒说明书[货号：KR116-02，FastKing RT Kit （with gDNAase）]。

1.2.2 柑橘黄龙病菌的检测

本研究采用实时荧光定量PCR（Quantitative PCR）的方法对柑橘叶片及柑橘果实中的黄龙病菌进行检测。所有检测试验均在ABI PRISM 7500 （Applied Biosystems， Foster City， CA， USA）上进行。同时以柑橘黄龙病亚洲种的部分16S rDNA序列为模板设计引物， 引物的设计主要参照Li 等的文章[11]：HLBas：5′-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3′，HLBr：5′-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3′，利用探针HLBp： 5′-6-carboxy-fluorescein （FAM）-AGACGGGTGAGTAACGCG-Black Hole Quencher（BHQ）-1-3′对样品进行检测。所用试剂为TaKaRa公司的Premix Ex Taq （Probe qPCR），所用引物和探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成。实时荧光定量PCR所用试剂如下（25 μL）： 12 μL Premix Ex Taq （Probe qPCR），0.5 μL HLBas/HLBr，1 μL HLBp，1 μL DNA（50 ng/μL），10 μL dd H2O。具體程序为：95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s 40个循环。程序运行结束后，读取Ct值。本团队利用标准品得到的Ct值与菌含量的关系为：Y=-0.286X+11.924，其中X为Ct值，Y为拷贝数，每克植物组织中含有的病原菌拷贝数为10Y。

1.2.3 柑橘病毒病的检测

为了对海南省主要‘福橙和‘绿橙产区橘园内的主要柑橘病毒病进行分析，根据已有参考文献中的检测引物，重点对柑橘衰退病、裂皮病、褪绿矮缩病、碎叶病和黄脉病进行检测[1214]， 具体引物序列见表1。以反转录获得的cDNA为模板，进行PCR反应，具体体系如下（20 μL）： Premix Ex Taq 10 μL，上/下游引物各 0.5 μL， cDNA（50 ng/μL） 1 μL， ddH2O 8 μL;具体程序如下：95℃ 5 min; 94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环;72℃ 5 min。 16℃保持。PCR结束后进行电泳，根据条带的有无对结果进行总结和分析。

2 结果与分析

2.1 海南‘福橙、‘绿橙主要产区柑橘黄龙病检测结果及发病情况

本研究采用荧光定量PCR（QPCR）方法分别在2017年春冬季对随机采自澄迈县和琼中县7个果园共109个柑橘样品进行柑橘黄龙病含量检测：其中‘福橙果园3个，样品共计56个;‘绿橙果园4个，样品共计53个，具体结果见表2。从表2中可以看出，澄迈县‘福橙标准化种植示范基地的柑橘黄龙病处于感病初期，2017年3月抽检样品的检出率为100%，平均菌含量很低，仅为（1.14±1.79）×103拷贝/g，2017年12月的检出率仅为8.3%;红湖农场种植园在2017年3月和12月的2次抽检中，叶片和果实样品的检出率均为100%;东义‘福橙示范基地2017年3月抽检叶片样品的检出率为100%，2017年12月叶片和果实样品的检出率均为88%。2017年3月对琼中县和平镇3个‘绿橙种植园的叶片抽检结果显示，3个果园柑橘黄龙病的检出率均为100%;2017年12月‘绿橙种植园1和3黄龙病的检出率为100%，‘绿橙种植园2为75%。2017年12月新增抽检果园营根镇‘绿橙种植园的检出率仅为11%。从表2中我们可以看出，来自澄迈县‘福橙标准化种植示范基地[（1.14±1.79）×103拷贝/g]和琼中县营根镇‘绿橙种植园[（0.03±0.05）×103拷贝/g]的样品含菌量远远低于其他被检果园样品的含菌量。究其原因，黄龙病不同发病程度可能与种植年限相关，从表中可以看出澄迈县‘福橙标准化种植示范基地为种植当地种苗2年左右的新植园，琼中县营根镇‘绿橙种植园为种植不足1年的新植园。值得注意的是，同为种植2年左右的果园，东义种植园柑橘黄龙病的检出率为88%以上，远远高于‘福橙标准化种植示范基地;同时前者的平均菌含量为后者的100倍以上。这些现象提示我们，黄龙病的发病程度除与种植年限有关外还与果园的田间栽培管理水平相关。

2.2 海南‘福橙、‘绿橙主要产区柑橘病毒病的检测结果及发病情况

研究表明，除柑橘黄龙病外，柑橘病毒病也严重影响柑橘生长和产量。本研究采用RT-PCR方法对柑橘样品中5种柑橘病毒病（柑橘衰退病、柑橘裂皮病、柑橘褪绿矮缩病、柑橘碎叶病及柑橘黄脉病）进行检测。结果表明，7个橘园均未检测到柑橘褪绿矮缩病毒;澄迈县3个‘福橙橘园都检出了柑橘衰退病毒（检出率分别为52.9%、100%、95.2%）、柑橘碎叶病毒检出率分别为41.2%、55.6%、38.1%）和柑橘黄脉病毒（检出率分别为100%、83.3%、85.7%）;除此之外，‘福橙标准化种植示范基地和东义‘福橙示范种植园还检出了柑橘裂皮病毒（检出率分别为11.8%和71.4%），而红湖农场‘福橙种植园未检出（表3）。

2017年12月采自琼中县4个‘绿橙橘园的柑橘叶片和果实均未检测到柑橘褪绿矮缩病毒和柑橘碎叶病毒;但都检出了柑橘衰退病毒（检出率分别为100%、93.8%、87.5%、77.8%）和柑橘黄脉病毒（检出率分别为90%、93.8%、93.8%、100%）。此外，和平镇‘绿橙橘园果园3的叶片和果实样品中还检出了柑橘裂皮病毒（检出率为43.8%）。具体结果见表2。

3 讨论

海南省是我国重要的亚热带水果产区之一，终年雨水充沛、长夏无冬、光热丰富，有利于亚热带作物的生长。除此之外，海南省全境属热带地区，占全国热带面积的42.5%，其中种植热带作物的面积占全省的23.9%，非常适合发展热带特色作物[15]。澄迈县位于海南北部丘陵台地，琼中县位于海南中部山地丘陵，都非常适合发展热带水果产业，两地均为海南省主要的柑橘产区。

结合本次收集到的7个果园的田间信息和分子检测结果发现，除种植年限较短的橘园，如澄迈县‘福橙标准化种植示范基地和琼中县营根镇‘绿橙柑橘黄龙病检出率和发病程度较轻外，其他橘园的柑橘黄龙病发病均较严重。值得注意的是，澄迈县福山镇东义‘福橙种植园同为种植年限较短的橘园，柑橘黄龙病的检出率已经达到了88%，发病程度也很严重（表2）;经查，该橘园的种苗来自外地繁育的无病种苗。同时对7个橘园柑橘病毒病的检测发现，新植园与老橘园在病毒病的发生种类上不存在差异，仅在检出率上有少许差距（表3）。这些现象暗示我们除了加强对橘园的水肥、除虫除草等田间管理外，加强种苗的检测，减少柑橘黄龙病和病毒病对柑橘苗木的污染源头也非常重要。

以往的调研报道表明，琼中地区样品柑橘黄龙病的检出率均小于100%，约为60%左右[16];在本次调研中采自琼中县和平镇3个种植园的样品柑橘黄龙病检出率均超过了75%，虽然在随机采样中会有一定的不确定因素存在，但也从侧面说明柑橘黄龙病在这些地区的危害程度正在进一步加重。从表2可以看出，澄迈县福山镇的3个果园，3月采集的柑橘叶片含菌量平均高出12月叶片样品的2倍以上，但是12月采集的果实样品中的含菌量远超同期叶片中的含菌量。由于3月采自琼中和平镇果园的样品为种植园1、种植园2和种植园3的混样，因此无法比较不同季节单一果园的含菌量。但是12月采自种植园2和种植园3的果实样品含菌量远超同果园叶片的含菌量。种植园1由于年久失管，果实小而且量极少，因此大量黄龙病菌仍存在于叶片中。这些现象暗示我们柑橘果园中12月（冬季）的黄龙病菌浓度远高于3月（春天）的黄龙病菌浓度;同时当柑橘植株挂果后，随着果实接近成熟存在柑橘黄龙病从叶片向果实转移的现象。以上这些结论仍需要进一步的试验进行验证。

基于本次调研中7个果园的具体情况，本文建议采取分类防控措施：1）澄迈县福山镇红湖农场‘福橙种植园和琼中县和平镇‘绿橙果园1和果园3不但柑橘黄龙病发生严重，而且处于失管状态或管理不善，需进行彻底挖除清园，并火烧处理被挖树体，进行整体重新规划重新种植或改种;2）澄迈县福山镇东义‘福橙示范基地和琼中县和平镇‘绿橙果园，虽然柑橘黄龙病发病严重，但果园管理优良也有良好经济产量和产值，需对果园加强监测，并对园中的病树采取彻底挖除，火烧处理被挖树体，同时可补种无病柑橘大苗（这样可以缩短柑橘结果前暴露在田间的时间，同时能够让果农尽快获得收益）[18];3）对于一些发病较轻、种植年限较短的橘园，如澄迈县‘福橙标准化种植示范基地和琼中县营根镇‘绿橙种植园，侧重于采取防病与防虫相结合、化学药剂与生物防治相结合的方法，在柑橘树抽梢期等特殊时期进行药剂喷洒，减少木虱数量;将四环素等抗生素通过输液的方式输送到柑橘树体内，可有效遏制柑橘黄龙病的发展，减少树体内病原菌的数量;增强树势，增加新梢，增加挂果等;4）对于需种植柑橘苗木的新植园，严格把控柑橘种苗的质量，加强对种苗柑橘黄龙病和病毒病的检测检疫，同时对果园不定期喷施杀虫杀菌药剂，加强柑橘不同生长时期木虱的防控力度，減少柑橘黄龙病的传播媒介;科学进行水肥管理，增强树势，提高树体的营养水平和自身抗病虫能力等。

综上所述，柑橘黄龙病和病毒病已经对海南省柑橘主产区澄迈县和琼中县的柑橘造成了严重的危害，发展和建立规范的无病种苗生产基地并加强柑橘种苗的检测检疫以及田间柑橘果园的栽培管理，有助于海南省减轻柑橘黄龙病和柑橘病毒病的发生和危害。

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（责任编辑：杨明丽）