美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测方法的建立

陈细红 杨小龙 廖富荣 高芳銮 沈建国

摘要 本文以我国台湾进境美人蕉病株为材料，根据已报道的美人蕉黄斑驳病毒Canna yellow mottle virus（CaYMV）基因序列设计2对特异性引物（外侧引物1对、内侧引物1对），建立了巢式PCR快速检测CaYMV的方法，并对进境的50份美人蕉样品进行了检测。结果显示，该方法特异性强，且灵敏度高于常规PCR，是常规PCR的1 000倍，表明该方法能够实现对CaYMV的快速、准确、灵敏检测，适用于口岸快速检测CaYMV。

关键词 美人蕉黄斑驳病毒; 巢式PCR; 检测

中图分类号： Q 503， S 41-30

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018283

美人蕉Canna indica L.是美人蕉科Cannaceae美人蕉属Canna的一种多年生草本花卉，主要分布于热带和亚热带地区，具有一定的观赏价值和药用价值，在我国常作为一种园林观赏植物进行引种栽培[14]。美人蕉在生长过程中易受病毒侵染，国内外关于美人蕉病毒病的研究较少，目前已报道的美人蕉病毒有菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus（BYMV）[5]、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus（CMV）、美人蕉矮化类病毒Canna stunt viroid[67]、美人蕉黄斑驳病毒Canna yellow mottle virus（CaYMV）[8]、美人蕉黄条病毒Canna yellow streak virus（CaYSV）[9]等。

美人蕉黄斑驳病毒（CaYMV）是美人蕉上的一种重要病毒，属于花椰菜花叶病毒科Caulimoviridae杆状DNA病毒属Badnavirus成员。其病毒粒体呈杆状，长约120～130 nm，直径约28 nm[10]，基因组为不完全环状双链DNA，含3个开放阅读框（open reading frame，ORF）。该病毒最早出现在日本和美国中北部[1113]，随后在意大利、荷兰[14]、印度[2]、肯尼亚[15]、中国[16]等国家陆续出现报道。CaYMV的寄主范围较窄，已报道的自然寄主为美人蕉。受侵染的美人蕉生长出现异常，典型症状为叶脉黄化，叶片、茎秆和花上出现条斑，组织逐渐坏死、变褐等，其观赏价值和经济价值均受到影响[1011]。CaYMV主要通过无性繁殖材料传播，可随美人蕉种苗的运输进行远距离传播，其传播介体尚未明确，且目前尚缺乏有效的防治该病的方法。

为有效降低CaYMV的传播和扩散，急需建立针对该病毒快速、灵敏的检测方法。国内外针对CaYMV检测方法的研究较少，沈建国等[10]报道了常规PCR检测该病毒的方法。与常规PCR相比，巢式PCR方法检测植物病毒具有更强的特异性和更高的灵敏度。张巧萍等[17]设计了凤仙花坏死斑病毒的特异性引物，建立了巢式PCR检测方法，提高了检测的灵敏度。闻伟刚等[18]通过建立烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测方法，灵敏度较常规RT-PCR方法提高了10 000倍以上。本文以我国台湾进境美人蕉病株为材料，根据已报道的CaYMV基因序列设计了2对特异性引物（外侧引物1对、内侧引物1对），建立了巢式PCR快速检测CaYMV的方法，以期进一步提高检测灵敏度和准确性，以满足口岸快速、准确检测CaYMV的需要。

1 材料与方法

1.1 材料

CaYMV毒源为我国台湾进境的美人蕉病株。菜豆黄花叶病毒（BYMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）以及番茄不孕病毒Tomato aspermy virus（TAV）的毒源（叶片）由本实验室保存。所有毒源均保存于-80℃冰箱中。

1.2 主要试剂

Plant Genomic DNA kit购自天根生化科技（北京）有限公司，2×Easy Taq PCR Supermix、TRIzol試剂购自北京全式金生物技术有限公司，随机引物、5×RT buffer、M-MuLV 反转录酶、RNasin、10 mmol/L dNTPs 购自Promega 公司，10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTPs、MgCl2、Taq DNA 聚合酶购自TaKaRa 公司。

1.3 引物设计与合成

杆状DNA病毒属通用引物BadnaFP/BadnaRP：ATGCCITTYGGIAARAAYGCICC/CCAYTTRC-AIACISCICCCCAICC，目的片段576 bp[19]。

根据已报道的CaYMV基因序列设计2对特异性引物，外侧引物为：上游引物CaYMVF1：5′-TAG-GGCAGTCAAGGATTAAGC-3′;下游引物CaYMVR1：5′-CAATCTTGGCGTAGAACGAG-3′，预期扩增片段大小为540 bp。内侧引物为：上游引物CaYMVF2：5′-ACTGCGTCAGTTTCTCGG-3′;下游引物CaYMVR2：5′-GGCCTGGATCTCAGCATCTA-3′，预期扩增片段大小352 bp。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 总核酸的提取

利用Plant Genomic DNA kit提取样品总DNA，方法参照试剂盒说明书。

1.5 PCR鉴定

以提取的DNA为模板，PCR反应体系（25 μL）为：2×Easy Taq PCR Supermix 12.5 μL，无菌水8.5 μL，BadnaFP（10 μmol/L）1 μL，BadnaRP（10 μmol/L）1 μL，DNA 2 μL。扩增条件为：94℃预变性7 min;94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环;最后72℃延伸7 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.6 巢式PCR检测

第一轮PCR以提取的DNA为模板，PCR反应体系（25 μL）为：10×PCR Buffer （Mg2+free） 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，CaYMVF1（10 μmol/L）1 μL，CaYMVR1（10 μmol/L）1 μL，无菌水13.8 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，DNA 2 μL。扩增条件为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环;最后72℃延伸10 min。第二轮PCR扩增以第一轮PCR产物为模板，反应体系为：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，CaYMVF2（10 μmol/L）1 μL，CaYMVR2（10 μmol/L）1 μL，无菌水15.6 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，第一轮PCR产物0.2 μL。扩增条件为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.7 序列测定及分析

PCR产物经回收纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测得的核苷酸序列在NCBI中运用BLAST程序进行同源性比较分析。

1.8 巢式PCR的特异性验证

菜豆黄花叶病毒（BYMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、番茄不孕病毒（TAV）提取总RNA后，反转录为cDNA，同携带CaYMV的样品DNA一起进行巢式PCR扩增，同时以健康美人蕉植株的DNA为模板设阴性对照，以无菌水为模板设空白对照，反应体系及扩增条件同1.6。

1.9 巢式PCR的灵敏度测定

将CaYMV的DNA原液进行10倍梯度稀释，分别以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9不同稀释度的DNA为模板，利用建立的巢式PCR方法进行扩增，同时设阴性对照，测定其灵敏度。

1.10 样品检测

利用建立的巢式PCR方法对口岸送检的一批美人蕉样品（共50份）进行检测。检测方法同1.4～1.7。

2 结果与分析

2.1 PCR鉴定

以提取的DNA为模板，以引物BadnaFP/BadnaRP进行扩增，结果从美人蕉病株中扩增出与预期大小一致的条带，约576 bp，而空白对照和阴性对照均未扩增出相应的特异性条带（图1）。将所得的目的片段进行克隆和测序，测得的序列进行BLAST比对，与已报道的CaYMV序列一致性达97%以上，证实样品携带有CaYMV。

2.2 巢式PCR检测

以第一轮PCR产物为模板，利用设计的内侧引物进行第二轮PCR，结果从带毒样品中扩增出与预期大小一致的条带，约352 bp，而空白对照和阴性对照均未扩增出相应的特异性条带（图2）。将所得的目的片段进行克隆和测序，测得的序列进行BLAST比对，与已报道的CaYMV序列（GenBank登录号：KT447042）一致性达99%。

2.3 巢式PCR的特异性验证

分别以BYMV、CMV、TAV的cDNA以及携带CaYMV的样品DNA为模板，在相同条件下进行巢式PCR，同时设阴性对照，结果从图3可见，仅携带CaYMV的样品在352 bp处出现明亮的DNA条带，其他病毒样品和健康样品均无条带，表明建立的巢式PCR方法具有较强的特异性。

2.4 巢式PCR的灵敏度测定结果

将携带CaYMV样品的DNA按10倍梯度稀释后，分别作为模板，单独使用CaYMVF1/CaYMVR1进行扩增，在1～3泳道均能扩增出540 bp的单一条带（图4a），而使用CaYMVF2/R2进行第二轮PCR扩增，在泳道1～6均能扩增出352 bp的条带（图4b）。第二轮PCR的检测灵敏度比第一轮PCR高103倍，即巢式PCR使检测灵敏度提高了103倍，由此表明，该病毒的巢式PCR的灵敏度明显高于常规PCR，前者的灵敏度是后者的103倍。

2.5 样品检测

检测结果表明，采用巢式PCR法能够从50份美人蕉样品中检测出CaYMV 9份（检出率为18%），比常规PCR检出率（8%）高10个百分点，表明本文建立的巢式PCR方法具有更高的灵敏度。

3 讨论

美人蕉黄斑驳病毒（CaYMV）是美人蕉上发生率较高的病毒之一，在美國、日本等美人蕉大面积种植的地区发生较为普遍，导致美人蕉的观赏价值和经济价值下降。目前尚未有针对CaYMV有效的防治方法，在美国曾被迫采取销毁病株的方式来防止其进一步扩散，给当地带来较大的经济损失[10]。因此，加强病毒检测，建立针对CaYMV快速、准确的检测方法，对有效防止该病毒随带病植株的远距离运输而扩散，保护我国观赏作物的生产安全意义重大。本文根据已报道的CaYMV序列设计了内、外侧2对特异性引物，在常规PCR的基础上，建立了可用于CaYMV快速检测的巢式PCR方法。

本文建立的巢式PCR方法仅能够从感染CaYMV的样品中扩增到特异性目的片段，而从其他病毒样品及健康样品中均未扩增到相应的目的片段，提高了PCR扩增的特异性，有效避免了非目的片段的扩增。与常规PCR相比，本文建立的巢式PCR方法经过2轮PCR反应，检测灵敏度得到显著提高，使整个PCR检测灵敏度提高了1 000倍（第一轮、第二轮的检测下限分别为10-2和10-5倍稀释的DNA）。应用本文建立的巢式PCR方法对进境的美人蕉样品进行CaYMV检测，检出率为18%，明显高于常规PCR的检出率，因此当CaYMV含量较低时，该方法能弥补常规PCR方法可能存在的漏检问题，使检测结果更为准确可靠。本文建立的巢式PCR检测CaYMV的方法具有快速、简便、特异和灵敏的优点，能够有效应用于CaYMV检测。

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（责任编辑：田 喆）