TMEM45A在肾透明细胞癌中的表达及作用机制研究

闫若东 任 山 隋文印 朴仁京

跨膜蛋白(Transmembrane protein，TMEM)是一种跨生物膜的蛋白质，绝大部分贯穿细胞膜脂质双分子层，少数位于细胞器膜上，是线粒体膜、内质网膜、溶酶体膜及高尔基体膜的重要组成成分[1]。大多数TMEM家族中的蛋白功能尚不清楚。研究发现，TMEM45A参与肿瘤的增殖、侵袭及化疗敏感性[1]。然而，TMEM45A在肾透明细胞癌(Clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)中的表达及作用尚无研究。本研究通过对公共数据库的挖掘，分析TMEM45A在ccRCC中的表达及与ccRCC分期、预后的关系，并利用细胞实验研究其对肾癌细胞增殖的影响。

1 资料与方法

1.1 Oncomine数据库提取数据

我们在Oncomine数据中根据自己的需求设定筛选和挖掘数据的条件。本研究中，(1)“Analysis Type：Clear Cell Renal Cell Carcinoma vs Normal Analysis”；(2)“Gene：TMEM45A”；(3)“Data Type：mRNA”；(4)临界值设定条件(P<0.0001，fold change>2，gene rank=top 10%)作为我们的筛选条件。由于Oncomine数据库非免费，我们先下载Oncomine官网上的源代码，然后利用R语言中的devtools和Oncomine包提取代码中的临床数据，最后对提取的数据进行分析。

1.2 GEPIA数据库分析

在GEPIA数据库(http：//gepia.cancer-pku.cn)中输入TMEM45A，选择样本数据库中的肾透明细胞癌，分析TMEM45A的表达水平及其与肾透明细胞癌分期、总生存时间(OS)及无病生存时间(DFS)的关系。以中位数为标准，分为高表达组和低表达组对样本进行生存分析。

1.3 组织标本

收集2015年1月—2018年12月在盘锦市中心医院行手术治疗且术后病理确诊为肾透明细胞癌的15对配对肾透明细胞癌及正常肾脏冰冻组织，其中男性9例，女性6例，平均年龄60.25±6.94岁，Grade Ⅰ：7例，Grade Ⅱ：4例，Grade Ⅲ：3例，Grade Ⅳ：1例。患者本人及其家属同意留取组织标本用于研究。本研究得到盘锦市中心医院伦理委员会的批准。

1.4 细胞培养

人肾癌786-O、Caki-1和正常肾小管上皮细胞HK-2细胞株来自中国科学院上海细胞研究所细胞库。使用含10%胎牛血清的培养基在37℃，5% CO2培养箱中培养。

1.5 qRT-PCR检测TMEM45A mRNA的表达

使用Trizol提取组织和细胞中RNA，用TaKaRa试剂盒进行逆转录及扩增。TMEM45A基因引物序列：上游：5′-CTCCTGGGCTGGCATCATTTC-3′，下游：5′-CGGCCATGAGTGTGGTTGTAG-3′；PCNA基因引物序列：上游：5′-GCCTGACAAATGCTTGCTGAC-3′，下游：5′-GCTGTTCTTGGCCTCAGTC-3′；Cyclin D1基因引物序列：上游：5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，下游：5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′；β-actin基因引物序列：上游：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游：5′-TGCCCAGGAAGGAAGGCT-3′。

1.6 Western blot检测TMEM45A蛋白

收集细胞，用含PMSF的裂解液提取总细胞蛋白。配制凝胶后每孔加入50 μg/孔，然后进行电泳、转膜、封闭，TMEM45A抗体、PCNA抗体和Cyclin D1(工作浓度：1∶1 000，Cell Signaling Technology)4℃孵育过夜，加二抗(Cell Signaling Technology)封闭液孵育2 h后ECL试剂(Boster)显色，具体步骤参考相关文献[2]。

1.7 转染

无义siRNA(NC)和三种针对TMEM45A siRNA(RNAi-1，RNAi-2，RNAi-3)由上海吉玛公司设计合成。无义siRNA序列：5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′；RNAi-1序列：5′-GGCCUUUAUCUUCUACAACUU-3′；RNAi-2序列：5′-GUUCCUUGUUCGGAACAAUUU-3′；RNAi-3序列：5′-AGUGUACUGUUUGCAUUUCUU-3′。利用脂质体Lipofectamin 2000(Invitrogen)作为载体将TMEM45A siRNA转入细胞中，48 h后收集细胞进行后续的实验。

1.8 CCK-8实验

取对数生长期细胞，每孔3 000个细胞加入96孔板中，TMEM45A siRNA转染Caki-1细胞6 h后换液，培养24 h、48 h、72 h后，加入MTS试剂，2 h后酶标仪检测吸光度值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 TMEM45A在不同肿瘤中的表达

Oncomine数据库中共收集了384项TMEM45A相关的研究，35项有统计学差异，其中25项TMEM45A高表达，10项TMEM45A低表达。4项肾癌相关的研究均显示在肾癌中TMEM45A表达升高(表1)。

表1 Onconime数据库中不同肿瘤的TMEM45A表达情况

2.2 TMEM45A在肾透明细胞癌中的表达情况

在Oncomine数据库中我们发现，共有4项研

究涉及TMEM45A mRNA在肾透明细胞癌和正常组织中的表达，共有115例样本(图1)。在Oncomine数据库中荟萃分析4项研究结果发现，与正常对照相比，TMEM45A mRNA在所有差异表达基因中的中位数值排名为1 697.5，P=0.004，提示TMEM45AmRNA在肾透明细胞癌中高表达。利用R语言分别提取Gumz、Jones、Lenburg、Yusenko 4项研究的数据，分析发现TMEM45A mRNA在肾透明细胞癌中的表达高于正常组织(图2)。

图1 TMEM45A在不同肾透明细胞癌数据集中的表达情况Figure 1 The expression of TMEM45A mRNA in different ccRCC datasets

图2 Oncomine 数据库中TMEM45A mRNA在4个肾透明细胞癌数据集中的表达情况Figure 2 The expression of TMEM45A mRNA in four ccRCC datasets in the Oncomine database

2.3 TMEM45A与肾透明细胞癌临床分期预后的关系

为明确TMEM45A与肾透明细胞癌的临床相关性，我们利用GEPIA数据库分析TMEM45A与肾癌的分期和生存的关系，发现TMEM45A在肾透明细胞癌中表达越高，肾透明细胞癌的分期也越高，而总生存时间及无病生存时间越短(图3)。

2.4 TMEM45A mRNA在肾透明细胞癌组织中的表达

利用qRT-PCR检测15对配对的正常肾组织及肾透明细胞癌组织中TMEM45A mRNA表达水平。结果显示，与正常肾组织相比，肾透明细胞癌组织中TMEM45A mRNA显著升高，具有统计学差异(P<0.05)(图4)。

图4 TMEM45A mRNA在15对配对肾透明细胞癌组织中的表达Figure 4 The expression of TMEM45A mRNA in 15 paired ccRCC tissuesNote：*P<0.05，when compared to the normal tissues.

图3 TMEM45A表达与ccRCC分期及预后之间的关系Figure 3 The relationship between the expression of TMEM45A and the stage or survival of ccRCCNote：A.The expression of TMEM45A in ccRCC(T)and normal kidney tissue(N)；B.The relationship between the TMEM45A expression and the stage of ccRCC；C.The relationship between the TMEM45A expression and overall survival of ccRCC；D.The relationship between the TMEM45A expression and disease free survival of ccRCC.*P<0.05.

2.5 TMEM45A对肾癌细胞增殖的影响

TMEM45A mRNA和蛋白在肾癌细胞株786-0和Caki-1中的表达显著高于HK-2细胞(P<0.001)(图5A)。由于TMEM45A在Caki-1细胞中的表达较高，因此选择Caki-1细胞进行后续的实验。利用TMEM45A siRNA(RNAi-1，RNAi-2，RNAi-3)干扰Caki-1细胞，发现TMEM45A mRNA表达明显下降，其中RNAi-2的抑制效率最高(图5B)。CCK-8实验结果显示，抑制TMEM45A表达后，2 d、3 d后Caki-1细胞的增殖能力明显受抑制(P<0.001)(图5C)。

图5 TMEM45A抑制后对细胞增殖的影响Figure 5 The effects of knockdown TMEM45A on cell proliferation in three kidney cell linesNote：A.The expression of TMEM45A mRNA and protein in three kidney cell lines；B.The influence on TMEM45A mRNA with different TMEM45A siRNAs；C.the influence on cell proliferation after inhibition of TMEM45A.*P<0.05，** P<0.001，when compared to the control group.

2.6 TMEM45A对细胞增殖相关蛋白的调控作用

为明确抑制TMEM45A后Caki-1细胞增殖能力下降的潜在调控机制，本研究利用siRNA抑制TMEM45A表达后检测细胞增殖相关蛋白PCNA和Cyclin D1的变化。结果显示，抑制TMEM45A后，PCNA和Cyclin D1的蛋白及mRNA表达均下降，差异具有统计学意义(P<0.05)(图6)。

图6 抑制TMEM45A后对细胞增殖相关蛋白的影响Figure 6 The influence on cell proliferation related proteins after inhibition of TMEM45ANote：A.The expression of TMEM45A，PCNA and cyclin D1 protein was detected by Western blot；B.The expression of TMEM45A，PCNA and cyclin D1 mRNA was detected by qRT-PCR.*P<0.05，when compared to the control group.

3 讨论

跨膜蛋白45A(TMEM45A)，属于TMEM蛋白大家族，由275个氨基酸，约有5到7个跨膜结构域，位于高尔基体上。据报道，TMEM45A参与表皮的角化[3-5]。最近有研究发现，在乳腺癌[5]、膀胱癌[6]、宫颈癌[7]和卵巢癌[8-9]中TMEM45A的表达明显升高，与肿瘤患者的预后不良密切相关[5，10]。与正常脑组织相比，TMEM45A在胶质瘤组织中显著高表达，同时发现随着胶质瘤组织学分级的增加，TMEM45A mRNA水平逐渐增加且与胶质瘤患者的不良预后相关。TMEM45A siRNA处理胶质瘤细胞后显著下调促进细胞周期的蛋白质(细胞周期蛋白D1，CDK4和PCNA)从而降低细胞增殖能力；同时通过下调细胞侵袭相关蛋白(MMP-2和MMP-9)抑制细胞迁移和细胞侵袭[10]。研究发现在紫杉醇耐受的乳腺癌细胞中TMEM45A明显升高；利用siRNA沉默TMEM45A可逆转乳腺癌细胞和肝癌细胞对化疗药物的耐受，说明TMEM45A在低氧导致的化疗耐受中起重要的作用；同时发现高表达的TMEM45A与乳腺癌患者预后不良显著相关[5]。Guo等研究发现TMEM45A在卵巢癌中高表达，沉默后显著下调TGF-β1、TGF-β2、RhoA和ROCK2的表达，显著抑制细胞增殖、促进G1期阻滞及抑制细胞侵袭。因此，TMEM45A在卵巢癌中起致癌基因的作用，可作为卵巢癌治疗的新靶点[9]。Thibodeau等通过对16例低分级、14例高分级的肾透明细胞癌及14例正常肾脏组织及6例良性肾疾病组织进行差异分析，发现TMEM45A mRNA在高分级的肾透明细胞癌中表达明显升高，且与细胞的分化过程及对低氧的反应相关[11]。在另一项研究中发现10个TMEM家族的基因在肾透明细胞中异常表达，仅TMEM45A和SLC35G2在肾透明细胞癌中表达升高[12]。目前对TMEM45A在肾透明细胞癌中的研究不多，具体的作用及临床意义尚不明确。

本研究我们利用Oncomine数据库发现TMEM45A mRNA在Gumz等[13]、Jones等[14]、Lenburg等[15]、Yusenko等[16]4项研究中表达升高。利用GEPIA数据库进一步分析显示，TMEM45A mRNA的表达水平与肾透明细胞癌的临床分期、总生存时间及无病生存期密切相关。肾癌患者的存活很大程度上取决于肿瘤的临床分期，因此TMEM45A可作为评估肾透明细胞癌患者预后好坏的标志物。同时我们在肾透明细胞癌组织中对数据库挖掘的结果进行验证，发现TMEM45A mRNA在ccRCC组织中高表达。为明确TMEM45A在肾癌细胞中的作用及调控机制，我们利用qRT-PCR和Wenstern blot检测HK-2、786-0和Caki-1细胞株中TMEM45A mRNA和蛋白的表达水平，结果显示TMEM45A在Caki-1细胞中表达相对较高；利用针对TMEM45A的siRNA抑制Caki-1细胞的TMEM45A表达，发现细胞增殖能力及PCNA和Cyclin D1表达明显下降，说明TMEM45A可能直接或间接地调控PCNA和Cyclin D1参与肾癌细胞的增殖。

综上所述，TMEM45A在肾透明细胞癌中表达显著升高，且与临床的分期、总生存时间及无病生存时间密切相关，有望成为判断肾透明细胞癌预后的标志物。体外细胞实验证实抑制TMEM45A后可显著降低肾癌细胞的增殖能力及PCNA和Cyclin D1的表达，为肾癌靶向治疗提供新的思路。本研究通过对公共数据库的挖掘，为我们的基础研究提供可靠的理论依据，为顺利开展实验提供保障。由于本研究中临床组织的样本量不够大，因此存在一定的不足。我们将继续收集肾癌的手术标本，扩大样本量，同时积极收集肾癌患者的临床资料及密切随访，进一步探讨其与肾癌的临床分期、分级及预后关系。