黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物的制备及其抗氧化性

史秋兰 何 旺 白红进

（塔里木大学生命科学学院／新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆阿拉尔843300）

黄芪多糖作为黄芪的主要有效成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、降血压、降血糖、肝肾保护等多种药理作用［1］。黄芪多糖因其来源广泛、资源丰厚、成本价廉，易得且毒副作用小，因此受到重视。近年来，对黄芪多糖的研究领域有所拓宽，逐渐采用不同改性方法对其结构进行修饰，并研究各种改性产物对机体影响机制及其量效关系，并在抗炎、抗氧化、免疫等方面做出了有益的探索［2-4］。

研究表明，铁是人体必需的微量元素之一［5-9］，当体内缺乏铁时，就会导致缺铁或缺铁性贫血。目前亚铁盐已被临床用于治疗缺铁性贫血，但由于其稳定性差，极易被氧化成三价铁盐从而对消化道刺激作用显著，且不易被机体吸收，因此，很少有人可以持续服用，尤其是幼儿。国内外的研究表明，多糖铁（III）复合物作为一种新型补铁剂，不仅具有多糖的生物活性，对胃肠道刺激作用不大。此外当其释放铁时，它可以被身体有效吸收和利用，产生毒性较小的副作用。因此，多糖铁作为一种具有良好配位稳定性的新型补铁剂［10］已成为近年来研究的热点。目前，研究领域中存在多种多糖铁复合物，如玉米多糖铁、党参多糖铁［11］、当归多糖铁、枸杞多糖铁［12］等。

本实验以黄芪多糖和氯化铁为原料合成黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物，将多糖与铁元素有机结合起来同时具有双重生物活性，而且减少了对肠胃刺激、副作用小，有利于肌体吸收。利用紫外-可见光谱、红外光谱两种表征手段对其进行表征，并用通过DPPH清除能力、ABTS清除能力、OH清除能力和还原力测定APS-Fe的抗氧化能力，为黄芪多糖铁的后续研究提供理论基础。

1 实验材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：黄芪多糖购自于成都埃法科技有限公司（大于95%），储存于2-8℃冰箱中

试剂：DPPH、ABTS购自于成都埃法科技有限公司。铁标准溶液（1000 ug/mL）、三氯化铁、柠檬酸钠、抗坏血酸、氢氧化钠、无水乙醇、磷酸二氢钾、邻二氮菲、七水合硫酸亚铁、30%双氧水、氯化钠、磷酸氢二钠、过硫酸钾、铁氰化钾和三氯乙酸均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA224S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；SHA-C数显水浴恒温振荡器（金坛华峰科技有限公司）；UV-752N型紫外/可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；DZ-2BC真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；Thermo iCAP 7000等离子体发射光谱仪（赛默飞世尔仪器有限公司）；ZF-A型紫外透射反射分析仪（上海骥辉科学分析仪器有限公司）；Nicolet 380（K）傅立叶红外光谱分析仪（日本岛津）；PHS-3C pH计（仪电科学仪器）。

2 实验方法

2.1 黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物的制备

参考王花［13］等的方法，精确称量2 g黄芪多糖，0.5 g柠檬酸钠放入带塞锥形瓶中，用60 mL蒸馏水溶解，将恒温水浴振荡器调节至70℃并连续振荡，同时缓慢加入2 mol/L氯化铁溶液和20%氢氧化钠溶液，用pH计调节溶液的pH为8.0～8.5，当溶液中出现沉淀时，立即停止滴加氯化铁和氢氧化钠，继续在恒温水浴中摇动1 h，取出反应液并冷却至室温，然后以3000 r/min离心10 min，将上清液倒入烧杯中，加入约3倍量无水乙醇，并将混合物在4℃冰箱中放置过夜，完全沉淀。将沉淀物溶于纯净水，将溶液置于透析袋中并用流水透析过夜，再用去离子水透析过夜。将透析袋（MW3500）中溶液倒入烧杯中，用无水乙醇洗涤2次，洗液合并。再用3倍体积无水乙醇完全沉淀，将沉淀放入60℃恒温真空干燥箱中干燥至恒重固体，得到黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物。

2.2 铁标准曲线的绘制

根据李玉贤［14］的方法，取7个50 mL容量瓶，分别加入10 ug/mL铁标准溶液0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，然后加入10%盐酸羟胺1.0 mL，邻菲罗啉显色液2.5 mL和5.0 mL醋酸钠（pH=4.5缓冲液），用蒸馏水稀释至刻度，放置10 min，以试剂溶液为空白在510 nm处测定吸光度，吸光度为纵坐标。

图1 铁的标准曲线

如图1所示，铁标准曲线的线性回归方程为y=0.2085x+0.0012，相关系数为0.9999。基于样品溶液的吸光度，由线性方程计算出样品的铁含量。

2.3 样品中铁含量的测定

称取0.018 9 g黄芪多糖铁（Ⅲ）样品，并稀释定容至50 mL容量瓶。从样品溶液中分别吸取溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，依次加入10%盐酸羟胺1.0 mL，邻菲罗啉显色液2.5 mL和5.0 mL醋酸钠（pH=4.5）缓冲液，蒸馏水稀释、定容，摇匀，放置10 min，在510 nm处以试剂溶液为空白，测吸光度。

称取0.016 9 g黄芪多糖铁样品，加入10 mL浓硝酸及0.5 mL高氯酸，盖上漏斗，浸泡2.5 h，消化至溶液呈透明或淡黄色液体，定容至10 mL容量瓶，通过等离子体发射光谱仪测定其铁含量。

2.4 结构表征

将黄芪多糖和黄芪多糖铁（Ⅲ）用去离子水配成0.1 mg/mL的溶液，参比溶液为去离子水，在波长200～400 nm范围内用紫外光谱扫描。

将少量的黄芪多糖和黄芪多糖铁（Ⅲ）粉末用KBr压片，使用傅里叶红外光谱进行红外光谱测定，测定范围为500～4 000 cm-1。

2.5 黄芪多糖铁（Ⅲ）水溶液稳定性测试

将适量的多糖铁溶于水，以亚铁氰化钾检验其水溶液，若未生成血红色溶液，证明多糖铁水溶液中不存在游离的Fe3+。

2.6 抗氧化活性测定

2.6.1 对羟自由基（·OH）的清除作用

准确吸取邻二氮菲溶液1.0 mL（1.5 mmol/L），依次加入0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4）2.0 mL和1.0 mL样品溶液，充摇匀，加入1.0 mL硫酸亚铁溶液（0.2 mol/L），混匀，加入1.0 mL 0.10%过氧化氢溶液，摇匀，置于恒温水浴（37℃）中1 h，测量波长510 nm处吸光度AS；以1.0 mL超纯水代替1.0 mL过氧化氢溶液来测定吸光度Ab。以黄芪多糖和芦丁标准品作阳性对照，按以上步骤操作，分别计算清除率。

OH清除率(%)=As/Ab×100

2.6.2对DPPH自由基的清除作用

准确地将不同浓度的黄芪多糖铁（Ⅲ）溶液吸取至试管中，加入 2.0 mLDPPH溶液（0.2 mmol/L），混匀，在室温下避光30 min，用无水乙醇在517 nm处调零并测定吸光度A1；精确移取不同浓度的黄芪多糖铁（Ⅲ）溶液于试管中，加入2.0 mL无水乙醇溶液，充分反应，室温下避光反应30 min，于517 nm处测定吸光度A2；取2.0 mLDPPH溶液，加入2.0 mL无水乙醇溶液，室温下避光反应30 min，于517 nm处测定吸光度A0。以黄芪多糖和芦丁标准品做阳性对照组，并按照以上步骤同时操作，分别计算清除率。

DPPH自由基清除率（%）=［1-（A1-A2/A0）］×100%

2.6.3对ABTS自由基的清除作用

精确移取0.89 mL过硫酸钾溶液（140 mmol/L）加入到50 mL ABTS自由基溶液（7 mmol/L）中，放置过夜，4℃下保存，制备成ABTS储备液。在实验之前将ABTS储备液恢复至室温，并将储备液稀释至在734 nm处具有0.70±0.02的吸光度，制成ABTS工作液。将0.2 mL不同浓度的样品溶液加入到3.8 mL ABTS工作液中，混合均匀，避光处理6 min，在734 nm处测定吸光值。以黄芪多糖和芦丁标准品作阳性对照，按以上步骤操作，分别计算清除率。

2.6.4 对总还原力的测定

移取1.0 mL不同浓度的黄芪多糖铁（Ⅲ）溶液，分别加入1.5 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4）和1.5 mL 10%铁氰化钾溶液，充分摇匀，在50℃水浴反应20 min,，冰袋迅速冷却，再加入10%的三氯乙酸溶液1.5 mL，以3000 r/min速度离心10 min，小心吸取上清液3.0 mL，并加入蒸馏水3.0 mL和0.5 mL的三氯化铁溶液，充分反应，静置10 min，于700 nm处测定吸光度。每组试验平行测定3次，并以黄芪多糖和芦丁标准品按照上述相同步骤操作，做阳性对照组。

3 结果与讨论

3.1 黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物的制备

称取黄芪多糖2.005 1 g，得到黄芪多糖铁复合物0.570 3 g，所得产率为28.44%。黄芪多糖中铁的含量为0.007 0 mg/g，合成的黄芪多糖铁复合物为红褐色颗粒，经邻菲啰啉紫外分光光度法测定其铁含量为57.36 mg/g，ICP等离子体发射法测定铁含量为53.95 mg/g。复合后铁含量增加了，说明铁复合成功。

3.2 黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物的紫外光谱法表征结果

图2 紫外光谱

由图2可知，三氯化铁、黄芪多糖铁无明显吸收峰。APS样品在275 nm处有吸收峰，说明APS中含有羰基结构，而APS-Fe样品中的吸收峰消失。吸收峰的明显变化，显示了化合物结构发生了变化，说明APS中的羰基与Fe3+发生反应，生成APS-Fe。

3.3 黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物的红外光谱法表征结果

图3 红外光谱

由图3可知，黄芪多糖铁和黄芪多糖红外吸收图谱未发生明显变化，说明在多糖在与铁螯合后多糖结构未发生明显改变。对比黄芪多糖铁和三氯化铁谱图发现黄芪多糖铁在1 606 cm-1、1 585 cm-1的特征吸收峰消失。从黄芪多糖与黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物两者的IR图谱吸收峰的位置来看，在多糖与铁配位后，多糖铁在3 406 cm-1处的O-H伸缩振动吸收峰蓝移至3 428 cm-1处且峰形变钝，说明多糖的羟基参与了络合反应。3 400 cm-1为O-H伸缩振动，2 920 cm-1处吸收缝为C-H伸缩振动，1 640 cm-1处吸收峰为C=O吸收峰，1450-1300 cm-1间的宽吸收峰C-H弯曲振动，1150-1050 cm-1间的三组吸收峰为C-O伸缩振动和C-O-C吸收。黄芪多糖铁在600cm-1处出现一个特征吸收峰，根据文献分析为FeOOH特征吸收峰，说明黄芪多糖铁中铁核具有聚合的类似FeOOH结构。

3.4 水溶液稳定性测试结果

用亚铁氰化钾检验黄芪多糖铁（Ⅲ）水溶液，未生成血红色溶液，则证明APS-Fe水溶液中不含游离的Fe3+。

3.5 抗氧化活性测试结果

3.5.1 对羟自由基（·OH）的清除作用

图4 对羟自由基（·OH）的清除作用

从图4可以看出，APS-Fe和APS对羟自由基的清除作用稍有差异，且清除作用均随着浓度的增长而增强。清除羟基自由基的次序为：芦丁＞APSFe＞APS。在APS-Fe的质量浓度为1 mg/mL时，其对羟自由基的清除率为65.83%。根据拟合方程，黄芪多糖的IC50值为0.418 3 mg/mL，黄芪多糖铁的IC50值为0.355 9 mg/mL。一般认为IC50值低于10 mg/mL则该种物质具有较好的抗氧化活性，因此说明APS-Fe仍具有较好的羟自由基（·OH）清除活性。

3.5.2 对DPPH自由基的清除作用

图5 对DPPH自由基的清除作用

由图5可知，APS-Fe和APS对DPPH具有一定的清除能力，随着浓度的增加，对DPPH的清除效果越好，这两者均呈现出量效关系。清除DPPH自由基的顺序为：芦丁＞APS＞APS-Fe。

3.5.3 对ABTS自由基的清除作用

图6 对ABTS自由基的清除作用

由图6可知，随着浓度的增大APS和APS-Fe对ABTS自由基的清除作用变化比较缓慢，在较高质量浓度下，对ABTS自由基具有一定的清除能力，且这两者对ABTS自由基的清除活性显著低于芦丁。清除ABTS自由基的顺序为：芦丁＞APS＞APS-Fe。

3.5.4 对总还原力的测定

图7 对总还原力的测定结果

由图7可以看出，黄芪多糖铁（Ⅲ）和黄芪多糖的总还原力相近，均具有一定的还原能力，还原能力随着溶液浓度的升高而增大。在0.02-1.00 mg/mL质量浓度范围内，芦丁具有明显的还原能力，芦丁的还原能力明显强于黄芪多糖铁（Ⅲ）和黄芪多糖的还原能力。

4 结论与讨论

本实验在弱碱性条件下，以氯化铁和APS为原料，合成制备稳定的黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物，产率为28.44%，通过邻菲罗啉紫外分光光度法和ICP等离子体发射法测定黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物中铁含量分别57.36 mg/g和53.95 mg/g。

采用紫外-可见光谱、红外光谱两种波谱学手段对铁复合物进行表征，通过对比黄芪多糖、黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物，以及三氯化铁的紫外光谱，发现黄芪多糖中羰基可能与铁发生反应，生成黄芪多糖铁（Ⅲ）复合物；而红外光谱表明黄芪多糖与铁络合，铁化反应可能是发生在-OH上，这与Q.L［15］文献报道的一致。

以芦丁为阳性对照，通过DPPH清除、ABTS清除、羟自由基清除和总还原力测定四种抗氧化试验，对APS和APS-Fe的抗氧化能力进行评价，发现APS和APS-Fe均具有一定的抗氧化能力，且抗氧化能力呈剂量依赖性。实验还发现APS-Fe的抗氧化能力稍低于APS,说明APS生成APS-Fe时，一些羟基、羰基与铁复合，使得APS-Fe的抗氧化活性降低，从侧面说明羟基和羰基是APS生成APS-Fe时发生反应的基团。

本实验合成APS-Fe复合物，具有稳定的铁含量，并具有一定的抗氧化活性，为APS-Fe的后期研发提供了一定的实验基础和理论依据，同时也为后续将APS-Fe开发成一种具有多重保健功能的生物多糖型补铁剂具有借鉴意义。