Pb和Cd复合污染土壤酶活性和苋菜重金属富集特征

王利民,李 昱,王煌平,张 青,栗方亮,罗 涛,黄东风

(福建省农业科学院 土壤肥料研究所,福建 福州 350013)

由于富含重金属的农药和化肥的不合理使用,土壤重金属污染日趋严重。重金属在土壤中难降解,毒性强,易累积,进入食物链后会危害人体健康[1]。菜地由于肥料和农药投入量较高,其重金属污染研究已成为热点。在国外,澳大利亚新南威尔士、津巴布韦的哈拉雷和乌干达首都坎帕垃市等地区菜地均被发现Cd、Pb含量超标[2-4]。在中国,自改革开放以来,蔬菜的种植面积从3.33×107hm2增至1.76×108hm2，蔬菜总产量达5.51×1011kg,人均产量313.0 kg,超过了世界平均水平,并跻身世界第三大蔬菜出口国[5]。但是,在中国24个省(市)城郊的320个污染区中,土壤重金属含量超标的农作物种植面积已经占到了中国总超标种植面积的80%以上,尤其是菜地的重金属超标现象十分严重[6]。因此,菜地重金属超标已逐渐成为威胁中国蔬菜发展且亟需解决的突出环境问题。

国内外学者就菜地重金属污染对土壤酶活性的影响开展了大量的研究。众所周知,土壤酶是土壤中一类具有高度催化作用的蛋白质,其活性的高低与土壤重金属污染程度存在密切的联系[7]。其中,土壤蛋白酶有利于促进土壤中氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物转化,从而为蔬菜提供丰富的氮源;过氧化氢酶则是一种重要的氧化还原酶,能酶促有害物质H2O2分解形成H2O和O2,进而缓解甚至消除H2O2的毒害作用。同时,这两种酶在重金属污染的土壤生态系统中发挥着极为重要的功能[8]。有研究表明,土壤酶活性一般随重金属处理浓度的增加而增强,但到达一定浓度后又开始逐渐减弱,其拐点浓度随土壤类型、土壤酶种类以及重金属元素的不同而不同[8]。

重金属污染除了直接影响土壤酶活性外,还会进一步威胁土壤上种植蔬菜的生产安全[9]。因为菜地土壤中重金属的累积,通常会引起蔬菜重金属含量超标。近年来,随着生活水平的不断提高,人们对蔬菜品质的要求也越来越高。目前,国内外对土壤-蔬菜系统中重金属的迁移累积特征及其对作物产量、品质的影响进行了大量研究。据1989～2015年资料,与蔬菜重金属污染相关的研究地域集中在江苏省、山东省和湖南省等省份,而福建地区的关注度相对较低。同时,研究对象主要是黄瓜、茄子和白菜等蔬菜品种,而对苋菜的研究甚少。苋菜在中国被广泛栽培,品种资源丰富,生长快且生物量大[10]。但是,苋菜属于叶菜类蔬菜,容易出现重金属超标的问题。但是,国内外有关苋菜品种受重金属元素污染的研究主要集中在单一污染元素Cd的研究[10-11]。然而,在自然界多数情况下,土壤重金属污染主要以复合污染的形式存在,且重金属间存在协同或拮抗作用,有别于单一重金属元素的作用[12]。同时,蔬菜使用的化肥中含有的重金属以Pb 和Cd 为主,这也是苋菜超标的主要重金属元素[9,13-14]。不同蔬菜品种对重金属的吸收、积累能力也存在差异。目前,有关苋菜品种红圆叶苋菜(AmaranthustricolorL.)对重金属Pb和Cd的富集和转运特征尚不清楚。为此,参照土壤重金属安全标准临界值,我们研究了不同水平重金属Cd和Pb复合污染条件下苋菜地土壤酶活性变化和红圆叶苋菜根系、可食部分对Pb和Cd的累积特征,以期为苋菜地土壤的重金属风险评价以及苋菜安全生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自福建省闽侯县白沙镇溪头村农业部福建耕地保育科学观测试验站实验田,为未受重金属污染的水稻土,属于黄泥田土。采集0～20 cm表土,室内风干、磨碎、混匀，过5 mm筛，用于盆栽实验。供试土壤的基本理化性状见表1。供试作物红圆叶苋菜的种子由万农高科股份有限公司提供。

表1 供试土壤的基本理化性质

1.2 试验方法

试验在玻璃温室中进行。供试盆钵顶端直径32 cm,底部直径10 cm,高15 cm。盆底垫20目尼龙网,装入7 kg干土。每盆土壤中分别均匀添加Cd(NO3)2·4H2O和Pb(NO3)2溶液。试验土壤Cd-Pb复合污染水平参考中国土壤重金属基准或最大允许浓度(表2)进行设计,并加水至田间持水量的80%；在土壤平衡6个月后,将每盆土壤倒出，再次充分混匀后播种。施肥水平为习惯施肥量的2.5倍,即盆栽苋菜的施肥量为磷酸一铵0.093 g/kg、氯化钾0.093 g/kg、尿素0.275 g/kg[15]。每处理3个重复,共9盆。于2016年8月8日播种,每隔l～2 d给土壤浇水1次,保持土壤湿润；在生长10 d左右后进行间苗,保留大小均一的苗15株,使其均匀分布于盆内。在整个实验过程中不做追肥处理。

表2 盆栽苋菜试验中土壤重金属污染物添加水平 mg/kg

1.3 测定方法

苋菜生长77 d后收获,并将其分为地下根系和地上植株两个部分。采集的样品分别用自来水冲洗后再用去离子水洗干净,先在105 ℃烘箱中杀青30 min,再于75 ℃温度下烘干至恒重,并分别测定根、地上部分干重。将干样粉碎、混匀并装袋备用。同时,用土钻采集盆栽土样,并风干、研磨、过筛，待测。

土壤基本理化性状分析参照土壤农化常规分析方法[16]:土壤pH值采用电位法测定;有机质用重铬酸钾容量法测定;阳离子交换量用EDTA-铵盐法测定;全氮用半微量凯氏法测定;全磷用钼蓝比色法测定;全钾用火焰光度法测定;碱解氮用碱解扩散法测定;有效磷用钼蓝比色法测定;速效钾用火焰光度法测定。植株重金属Cd、Pb含量的测定采用HNO3-H2O2微波消解-石墨炉原子吸收分光光度法。土壤全Cd、Pb和有效态Cd、Pb含量采用原子吸收分光光度法[17]测定。土壤过氧化氢酶的活性依照杨兰芳等[18]的紫外分光光度法测定；蛋白酶的活性用茚三酮比色法[19]测定。

1.4 相关指标

1.4.1 富集系数和转运系数 富集系数(BCF)是指植物体内某种重金属含量与土壤中同种重金属元素含量的比值,反映植物对土壤中重金属元素的积累能力[20]。转运系数(BTF)指植物地上部分中某重金属元素含量与根部该重金属含量的比值,反映了该重金属由根部向地上部分迁移的能力[21]。它们的计算公式如下:

BCF=植株体内重金属元素含量/土壤中重金属元素含量；

BTF=可食部分重金属元素含量/根系中重金属元素含量

1.4.2 苋菜重金属超标倍数 苋菜重金属超标倍数的计算公式[22]为:R=M/N,式中:R为苋菜超标倍数;M为食用器官中重金属的实测值;N为食用器官中重金属含量的标准限值。当R≤1时,表示苋菜安全;当R>1时,表示苋菜开始受到污染。

1.5 数据分析

通过SAS 8.02统计分析软件对土壤和植株中的重金属Pb、Cd含量,以及植株生物量等数据进行ANOVA方差分析和Duncan’s新复极差法多重比较,并进行相关性分析。其他统计分析采用Microsoft Office Excel 2003软件。

2 结果与分析

2.1 不同水平的重金属复合污染处理对土壤Cd和Pb有效量的影响

由表3可知,苋菜收获后,残留在土壤中重金属Cd和Pb的有效量均随添加重金属浓度的增加而升高。其中,T1和T2处理土壤Cd的有效量分别比CK增加了9.00、41.00倍;土壤Pb的有效量相应地增加了6.71、10.21倍。参照农产品产地土壤重金属污染程度的分级标准(表4)[23]可知：对照CK苋菜地土壤中Cd和Pb的有效量均低于安全值,污染状况处于安全级；但是,T1、T2处理土壤Pb的有效量均大于高危值80 mg/kg,表明这两个处理的土壤污染情况已处于高危级。

表3 Cd和Pb复合污染土壤重金属的有效量 mg/kg

注:同一列数据后附不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05),下同。

表4 农产品产地土壤重金属污染分级标准(有效量) mg/kg

2.2 不同水平的重金属复合污染处理对苋菜的重金属含量、生物量、生物富集和转运系数的影响

从表5可知,随着处理土壤添加重金属浓度的增加,苋菜可食部分的Cd和Pb含量均明显(P<0.05)升高,其中,处理T1、T2的苋菜可食部分Cd含量比CK分别增加了2.31、10.71倍,可食部分Pb含量也相应地增加了2.19、26.19倍;处理T1、T2的苋菜根系Cd含量比CK分别增加了2.31、28.5倍,根系中Pb的含量相应增加了9.34、10.64倍。参照食品安全国家标准GB 2762─2012[24],CK土壤中苋菜重金属超标倍数R≤1,表示苋菜安全;而处理T1和T2的土壤苋菜R>1,表示苋菜在这两个处理中开始受到污染,且随着污染水平增加而加重。与CK相比,苋菜对Cd的BCF随着重金属污染水平的增加而降低,但T1与T2处理间差异并不显著;苋菜对Pb的BCF先升高后降低,在T1处理中达到最大,说明苋菜对Pb的富集能力在复合污染程度相对较轻的土壤中较强。此外,苋菜对Cd的BTF在T1处理中未有显著变化,而随着重金属污染水平进一步增加,在T2处理中出现显著(P<0.05)下降,说明苋菜在Cd-Pb复合污染程度较重的土壤中吸收重金属Cd后,从根部向茎、叶转移Cd的能力开始变弱;而苋菜对Pb的BTF则随着污染水平的增加而增强,表明苋菜吸收重金属Pb后,随着污染程度加重,从根部向茎、叶输送Pb的能力变强。苋菜对重金属Cd的富集和转运能力均明显高于Pb,说明苋菜更容易积累Cd;而且,Cd更容易积累在苋菜的可食部分,而Pb易滞留在苋菜的根系部位。与CK相比,处理T1和T2的苋菜生物量均有不同程度的下降,而T1和T2间的苋菜生物量并未有明显(P<0.05)的差异(图1)。

表5 不同重金属Cd和Pb复合污染水平下苋菜的重金属含量、生物富集系数及转运系数

注:叶菜限量值依据干重进行计算。“/”表示未检出; BTF为生物转运系数; BCF为生物富集系数。

图中不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

2.3 不同水平的重金属复合污染处理对土壤酶活性的影响

与CK相比,处理T1土壤蛋白酶活性未有明显的变化,而T2处理土壤蛋白酶活性则有显著(P<0.05)增强(图2),活性增强的蛋白酶有利于促进土壤中含蛋白质氮的有机化合物转化,为苋菜提供丰富的氮源。同样,处理T1土壤过氧化氢酶活性与CK未有显著差异,但处理T2土壤过氧化氢酶活性明显(P<0.05)减弱(图2),这将进一步导致H2O2在苋菜体内累积,产生毒害作用。总之,高浓度的Cd和Pb复合污染处理对土壤蛋白酶具有明显的激活效应,而对过氧化氢酶则表现出强烈的抑制作用。

图2 重金属Cd和Pb复合污染处理下土壤酶活性的变化

2.4 土壤重金属有效量、土壤酶活性、苋菜根系重金属含量和苋菜可食部分重金属含量间的相关性

由表6相关性分析可知,苋菜生物量与土壤Cd、Pb有效量、BTFPb、根系和可食部分Cd、Pb的含量均有极显著(P<0.01)的负相关性,表明在土壤-苋菜系统中Cd、Pb含量过高会抑制苋菜的生物量累积。另外,苋菜可食部分Cd、Pb含量与根系中Cd含量、BTFPb,以及土壤Cd、Pb有效量均有极显著(P<0.01)的正相关性,而与土壤过氧化氢酶活性具有极显著(P<0.01)的负相关性。

表6 土壤重金属有效量、苋菜根系和可食部分重金属含量间的相关系数

注：R0.05=0.666,R0.01=0.798,n=9；“*”和“**”分别表示相关性达到显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平;PbV为可食部分Pb含量(mg/kg);CdV为可食部分Cd含量(mg/kg);PbR为根系Pb含量(mg/kg); CdR为根系Cd含量(mg/kg); CdA为土壤Cd有效量(mg/kg); PbA为土壤Pb有效量(mg/kg); BTFCd为Cd的转运系数; BTFPb为Pb的转运系数; BCFCd为Cd的富集系数; BCFPb为Pb的富集系数。

3 讨论

参照《农产品产地土壤重金属污染程度的分级》[23],本研究表明CK土壤未遭受明显Cd和Pb重金属污染,处于安全级。在安全级土壤上,绝大多数作物的产品中重金属含量不会超过国家食品污染物限量标准,可以安全生产。然而,T1、T2处理土壤污染情况处于高危级,表示土壤已经遭受严重的重金属污染。在高危级土壤上,大多数农作物的产品中的重金属含量会超出食品污染物限量标准,仅少数对土壤重金属吸收富集能力弱且对重金属毒害不敏感的作物才可以安全种植。在未经修复的高危级土壤上,除了那些已被确认可以安全生长的农作物以外,其他农作物均不宜种植。只有当这类土壤经过修复以后,重金属的有效量降低到了作物可以安全生长的程度,才可以选择性地恢复种植食用农作物。

由食品安全国家标准GB 2762─2012[24]可知,本研究中CK土壤中种植的苋菜安全,而处理T1和T2土壤中苋菜均受到了Cd和Pb的污染,且污染程度随着重金属水平增加而增加。此外,土壤Cd的BCF和BTF分别为0.085～0.105和1.39～3.50, Pb的BCF和BTF分别为0.001～0.003和0.00～0.07,表明苋菜对重金属Cd的富集和转运能力均明显高于Pb,说明苋菜更容易积累Cd。这是因为在Pb和Cd复合污染条件下,Pb可能会夺取Cd在土壤中的吸附位点而提高土壤中Cd的有效性或者取代被根吸附的Cd,促进根中滞留Cd的活性而进一步向茎叶迁移[25]。由此推断,同一蔬菜对不同重金属的吸收能力是不同的。即使是同种蔬菜的不同品种,它们对同种重金属的吸收积累能力也不一样。据李凝玉等[10]报道,生长在5 mg/kg Cd污染土壤中的红苋(AmaranthuspaniculatusL.)和绿苋(AmaranthuspaniculatusL.)的BCF值高达22.4～40.2, BTF为1.0～2.0,均达到超富集植物的要求,这与本研究的苋菜品种(A.tricolorL.)不一致。本研究进一步表明重金属元素Cd更容易积累在苋菜的可食部分,而Pb易滞留在根系部位。这与杜应琼等[26]的研究结果基本一致。这是因为在Cd胁迫下蔬菜根系有可能会大量分泌总有机酸、游离氨基酸和可溶性糖等有机物,从而促进蔬菜对Cd的吸收[27]。

酶在土壤中广泛分布,它们能够催化土壤中复杂有机物转化为简单无机物供植物生长。由于环境重金属污染,土壤酶活性变化很大,进而会影响土壤养分的释放和作物的生长。因此,土壤酶活性是土壤自净容量的一个标志。同时,因为土壤酶活性对生态环境变化的敏感性,所以它被作为土壤污染的重要生物活性指标,用于评价土壤污染[28]。本试验结果表明,高浓度的Cd和Pb复合污染对土壤蛋白酶活性具有明显的促进效应,而对过氧化氢酶活性则表现出强烈的抑制作用。但当土壤Cd的含量为1.0 mg/kg时,土壤过氧化氢酶活性增强,说明低浓度Cd能提高土壤过氧化氢酶的活性[29]。这是因为酶作为蛋白质,需要一定量的重金属离子作为辅基,而重金属的加入能促进酶活性中心与底物间的配位结合,使酶分子及其活性中心保持一定的专性结构,改变酶催化反应的平衡性质和酶蛋白的表面电荷,从而增强酶的活性,表现出重金属对土壤酶的激活作用[30]。但是,如果土壤重金属浓度过高,则它会占据酶的活性中心,与基质发生络合作用,并钝化酶的蛋白质活性基团,即与酶分子的巯基、氨基和羧基结合,从而破坏酶的结构,阻碍酶参与化学反应,导致酶活性降低,表现出重金属具有抑制土壤酶活性的效应[31]。此外,重金属对土壤酶活性的影响还与重金属自身的种类、浓度以及土壤理化性质、土壤酶类型等因素有关[32]。

4 结论

本研究结果表明：对照土壤未遭受明显的重金属Cd和Pb污染,处于安全状态,而处理T1和T2的土壤均已开始受到污染。此外,较低浓度的Cd和Pb复合污染对土壤蛋白酶和过氧化氢酶活性未有明显的影响,而高浓度复合污染则对蛋白酶活性具有激活作用,而对过氧化氢酶活性表现出抑制效应。但是,随着重金属污染水平的增加,苋菜可食部位Pb和Cd的含量也会出现超标现象;可食部分Pb的含量比根中低,而可食部分Cd含量明显高于根系,且苋菜对重金属Cd的富集能力强于Pb。