星点设计-效应面法优化酶法提取黄连中盐酸小檗碱工艺

杨红艳 许建丽

摘要：目的  研究黄连中盐酸小檗碱的酶法辅助超声提取工艺，并优化酶解工艺参数。方法  采用果胶酶酶解后超声促提方法提取黄连中的盐酸小檗碱，在单因素试验的基础上，选取酶用量、酶解温度和酶解pH值为影响因素，通过星点设计-效应面法优化酶解工艺参数，并利用多元线性回归和二项式回归建立预测模型。结果  最佳酶解工藝为酶用量1.33%、酶解温度45.8 ℃、酶解pH值2.68，在该优化条件下，盐酸小檗碱提取率为96.3%，与模型预测值（97.0%）相差0.7%。结论  采用酶法辅助超声提取可充分提取出黄连中的盐酸小檗碱，且利用二项式回归所建立的模型具有较好的预测性。

关键词：黄连;盐酸小檗碱;酶法提取;星点设计-效应面法

中图分类号：R284.2    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）07-0089-05

Abstract： Objective To study the enzymatic assisted ultrasonic extraction process of berberine hydrochloride from Coptidis Rhizoma; To optimize enzymatic hydrolysis parameters. Methods Berberine hydrochloride was extracted from Coptidis Rhizoma by pectinase enzymatic hydrolysis and ultrasonic extraction. Base on single factor experiments， three factors of enzyme dosage， enzymolysis temperature， and pH value were chosen to optimize the pectinase extraction conditions by central composite design and response surface method. The prediction model was established by multiple linear regression and binomial regression. Results The optimum enzymatic hydrolysis process was as follows： the enzyme dosage 1.33%， the enzymolysis temperature 45.8 ℃， and the pH value 2.68. Under these conditions， the extraction rate of berberine hydrochloride was 96.3%， which was different from the model prediction （97.0%） by 0.7%. Conclusion The method of enzymatic assisted ultrasonic extraction can be used to extract berberine hydrochloride from Coptidis Rhizoma. Meanwhile， the established binomial regression model has better predictability.

Keywords： Coptidis Rhizoma; berberine hydrochloride; enzymatic extraction; central composite design and response surface method

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎，其味苦、寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的功效。黄连主要有效成分是以盐酸小檗碱为代表的生物碱类化合物，属于苯并异喹啉类季铵型生物碱，具有多种药理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗心力衰竭、降血压、抗肿瘤，以及对肠道疾病、糖尿病和急性肺损伤的治疗作用等[1-3]，用途极为广泛。因此，如何最大限度从黄连中提取盐酸小檗碱，从而有效利用资源，具有重要意义。

目前，盐酸小檗碱的常规提取主要采用酸水、乙醇为溶媒进行回流、冷浸等方法处理[4]，普遍存在提取耗时较长、步骤多、消耗溶剂量大、提取效率相对较低的缺点。近年来，为了提高提取效率，新的强化提取技术（如微波技术、酶工程技术、超声波技术等）被广泛应用于中药有效成分的提取[5-6]。其中，酶工程技术可根据植物细胞壁的构成特点，利用酶降解细胞壁的组成成分，破坏细胞壁结构，使活性成分充分暴露溶出，从而提高中药有效成分提取率[7]。而超声波技术可利用超声波产生的强烈振动、空化效应、搅拌作用等加速植物有效成分进入溶剂，提高提取率，缩短提取时间，简化操作步骤[8-9]。因此，本研究选择采用酶法辅助与超声促提相配合的复合提取工艺，以期最大限度提取黄连中的盐酸小檗碱，提高资源利用率。

在工艺优选的试验设计方法上，目前较多采用的试验设计方法有正交设计、均匀设计及星点设计-效应面优化法，前两者在试验处理时可以取得较佳点，基本可以满足一般试验的要求，但存在试验精度不够、选择的试验取值仅接近最佳取值而无法精确找到最佳点、条件优选凭经验、不能灵敏考察各因素间的交互作用等缺点;而采用星点设计-效应面法设计试验优化方法，具有试验次数少、试验精度高、预测值精准等优点，常被用于提取工艺优化中[10-13]。因此，本试验采用星点设计-效应面法优化提取黄连中盐酸小檗碱的酶解工艺参数，并建立预测模型，确定黄连中盐酸小檗碱的最佳提取方案。

1  仪器与试药

LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-20A紫外检测器（日本岛津公司），AL 104电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），T9双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），DL-480E智能超声清洗器（上海之信仪器有限公司），GWA-UP1-F超純水器（北京普析通用仪器有限责任公司），SHZ-D循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），PHSJ-3F实验室pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司），KHW-8-8电热恒温水浴锅（上海科恒实业发展有限公司）。

黄连药材（产地四川），经岭南师范学院制药工程系夏敬民教授鉴定为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎;盐酸小檗碱对照品（批号110713-201613，纯度86.8%），中国食品药品检定研究院;果胶酶（批号P034901），华迈科生物技术有限责任公司;甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2  方法与结果

2.1  盐酸小檗碱含量测定

2.1.1  色谱条件

色谱柱为Pgrandsil-STC-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;流动相为乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（以磷酸调节pH值为2.5）=35∶65，流速为1.0 mL/min，检测波长为266 nm，柱温为35 ℃，进样量为20 ?L。色谱图见图1。

2.1.2  对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品10.7 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（0.371 mg/mL）。

2.1.3  供试品溶液的制备

取黄连药材粉末（过24目筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率99 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 ?m微孔滤膜过滤，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.4  标准曲线的绘制

精密量取对照品贮备溶液（0.371 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成浓度分别为7.42、14.84、22.26、29.68、37.10、44.52、51.94 ?g/mL的系列溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，各精密吸取20 ?L注入液相色谱仪，记录峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=1 044 418.82X+50 893.75（R2=0.999 6），结果表明盐酸小檗碱在7.42～51.95 ?g/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5  精密度试验

精密吸取对照品溶液20 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件，重复进样5次，测定其峰面积，结果峰面积RSD=1.43%，表明仪器精密度良好。

2.1.6  稳定性试验

取新制备的供试品溶液，分别于放置0、2、4、6、12 h，按“2.1.1”项下色谱条件，进样20 ?L，测定其峰面积，结果峰面积RSD=1.51%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.7  重复性试验

取同一批黄连药材粉末5份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 ?L，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定，分别计算盐酸小檗碱含量，计算得RSD=1.62%，结果表明该方法重复性良好。

2.1.8  加样回收率试验

精密称取已知含量（54.8 mg/g）的黄连药材粉末约0.1 g，共9份，每3份分别精密加入相当于盐酸小檗碱含量80%、100%、120%的对照品，按“2.1.3”项下方法制备，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果平均回收率为101.49%，RSD=2.70%，表明该法准确度高。

2.2  盐酸小檗碱提取工艺

称取黄连药材粉末2.00 g，置于具塞锥形瓶中，加入适量蒸馏水（调节pH=4.0），加入适量果胶酶，置于35 ℃水浴中恒温酶解2 h，过滤，收集滤液，将酶解后的黄连药渣加蒸馏水超声（功率99 W，频率40 kHz）提取2次，每次25 min，合并滤液，定容至100 mL，从中精密吸取1 mL，置于50 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得样品溶液。精密吸取样品溶液20 ?L，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算盐酸小檗碱含量及提取率。盐酸小檗碱提取率（%）=（C×50×100）÷（2×1000×M）×100%。式中，C为样品溶液中盐酸小檗碱含量（?g/mL），M为黄连药材中盐酸小檗碱含量（54.8 mg/g）。

2.3  单因素试验

2.3.1  酶用量考察

称取黄连药材粉末2.00 g，共6份，分别置于具塞锥形瓶中，加8倍量蒸馏水（调节pH=4.0），调节果胶酶用量（质量分数）分别为0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%，考察酶用量对盐酸小檗碱提取率的影响，结果见图2。

可以看出，随着酶用量的增加，提取率逐渐增大，酶用量为1.5%时提取率达到最大，此后再增加酶用量，提取率反而下降，这可能是酶达到饱和后，酶量增加反而抑制了酶促反应。故最佳酶用量为1.5%。

2.3.2  酶解时间考察

称取黄连药材粉末2.00 g，共6份，分别置于具塞锥形瓶中，加入8倍量蒸馏水（调节pH=4.0），固定酶用量为1.5%，调节酶解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察不同酶解时间对盐酸小檗碱提取率的影响，结果见图3。可见，盐酸小檗碱提取率随酶解时间延长而升高，在2.5 h时达到最大值，随后延长酶解时间提取率反而下降，故确定最佳酶解时间为2.5 h。

2.3.3  酶解pH值考察

称取黄连药材粉末2.00 g，共5份，分别置于具塞锥形瓶中，加入8倍量蒸馏水，调节pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，考察不同的酶解pH值对盐酸小檗碱提取率的影响，结果见图4。可见，盐酸小檗碱提取率随pH值增大而升高，在pH=3.0时达到最大值，随后再增大pH值，提取率逐渐下降，说明在较低pH值条件下更有利于果胶酶活性的发挥，故确定最佳酶解pH值为3.0。

2.3.4  酶解温度考察

称取黄连药材粉末2.00 g，共5份，分别置于具塞锥形瓶中，加入8倍量蒸馏水（调节pH=3.0），固定酶用量为1.5%、酶解时间为2.5 h，调节酶解温度分别为30、35、40、45、50、55 ℃，考察不同的酶解温度对盐酸小檗碱提取率的影响，结果见图5。可见，盐酸小檗碱提取率在30～40 ℃之间随酶解温度升高而增大，高于40 ℃后提取率下降，可能由于温度过高导致酶活性下降。故最佳酶解温度为40 ℃。

2.4  星点设计-效应面法优选酶解工艺

2.4.1  试验设计

在单因素考察基础上，用星点设计-效应面法对酶解工艺的主要影响因素进行优化，选择酶用量、酶解温度和pH值作为考察对象，采用三因素五水平表进行试验，各因素水平编码值见表1，试验设计及结果见表2。

2.4.2  模型拟合与方差分析

以盐酸小檗碱提取率为因变量，酶用量（A）、酶解温度（B）和酶解pH值（C）为自变量，采用Design-Expert8.0.6软件对数据分别进行多元线性、二项式拟合。多元线性回归方程：Y=36.164+3.489A+0.890B+4.726C（R2=0.556 2，P=0.003 9）;二项式回归方程：Y=-334.267+23.755A+13.943B+69.381C-1.331AB+0.887AC-1.156BC+10.102A2-0.095B2-3.293C2（R2=0.916 0，P=0.000 3）。结果表明，多元线性回归及二项式拟合模型均有统计学意义（P<0.01），但多元线性回归模型的决定系数较低，且失拟项较显著（P=0.024 2），说明该模型拟合不佳，预测性较差，因此多元线性模型不合适，选取二项式拟合模型进行方差分析。结果显示，拟合模型P<0.001，失拟项P=0.238 3，决定系数大于0.9，表明该模型具有很好的拟合度，可用于分析和预测效应值。由拟合方程回归系数显著性检验的F值和P值可知，三因素对效应值的影响为酶解温度（B）>酶解pH值（C）>酶用量（A）。一次项B、C，交互项BC及二次项B2对盐酸小檗碱提取率有显著影响（P<0.01），见表3。

2.4.3  效应面分析及工艺优选

根据二项式拟合模型绘制三维效应面与等高线图，其中另一个自变量取中间值，见图6。由效应面曲线可直观分析各因素交互作用的影响情况，曲面越陡峭、弯曲度越大表明效应值对条件的改变越敏感，该因素的交互作用对盐酸小檗碱提取率的影响就越大。可以看出，酶解温度和酶解pH值对盐酸小檗碱提取率的影响最大，提取率随酶解温度升高逐渐增大，随酶解pH值升高呈先增大后减小的趋势;酶用量在取值范围内对提取率的影响不大。通过对回归方程分析及优化求解，得最优酶解工艺参数为酶用量1.33%、酶解温度45.8 ℃、酶解pH值2.68，在此条件下盐酸小檗碱提取率预测值为97.0%。

图6  各因素对盐酸小檗碱提取率影响的效应面和等高线图

2.4.4  验证试验

根据星点设计-效应面法优选出的最佳工艺条件进行酶法提取验证试验，平行试验3次，结果盐酸小檗碱提取率分别为96.4%、96.1%、96.4%，平均提取率为96.3%，实测值与预测值误差为0.7%，说明本研究建立的模型具有较好的预测性，优化得到的酶法提取黄连中盐酸小檗碱的工艺条件准确可靠。

3  讨论

本试验研究了酶法提取黄连中盐酸小檗碱的工艺参数。前期研究对超声促提工艺条件进行了筛选，确定工艺条件为以8倍量蒸馏水作为溶媒、超声提取2次、提取时间为25 min，并比较酶法与非酶法对盐酸小檗碱提取率的影响，结果发现酶法能显著提高盐酸小檗碱提取率，因此最终确定采用酶法辅助超声促提方法，并通过星点设计-效应面法优化酶法提取的酶解工艺，得到优化后的酶解工艺参数为：酶用量1.33%、酶解温度45.8 ℃、pH值2.68，在此优化工艺条件下，黄连中盐酸小檗碱提取率可达96.3%，表明采用酶法辅助超声促提方法可基本将黄连中的盐酸小檗碱提取完全，可為含有盐酸小檗碱类成分的药材资源有效利用提供参考方法及试验依据。

以酸水或乙醇为溶媒从黄连中提取盐酸小檗碱，常采用煎煮、回流、冷浸等方法，除存在周期长、工序多、提取率不高等缺点外，酸水易造成环境污染，容易腐蚀设备，而以醇为溶媒溶剂回收操作繁琐，总体耗时长。本研究选择以水为溶媒，将酶法与超声技术联合应用于黄连中盐酸小檗碱的提取，与传统提取方法相比，有效提高了盐酸小檗碱的提取率，节约了提取时间。本研究可为黄连中盐酸小檗碱的提取提供一种条件温和、环保、经济、操作简便的方法。

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