神经介素U对新生大鼠坏死性小肠结肠炎的影响

(浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058)

坏死性小肠结肠炎(NEC)是早产儿最常见的一种疾病，常在没有任何预兆的情况下出现，并且迅速演变为肠道坏死，严重者直接导致死亡。自60多年前，现代新生儿重症监护开始以来，NEC已被广泛认可[1]。但至今NEC的发病机制还没完全明了，这严重限制了NEC的预防和治疗。

神经介素 U 是从猪脊髓分离的一种神经肽，由于它在体外可使大鼠的子宫肌收缩，因此加后缀 U(英语子宫 uterus 的首字母) 命名为 NMU。随着深入研究，NMU 主要分布于胃肠道、泌尿生殖系统和中枢神经系统。在胃肠道中，黏膜和肠肌层的神经细胞体和纤维中存在NMU-LIR[2]。但神经介素U的其他功能，是否抑制细胞凋亡、能否通过抑制细胞凋亡和促进细胞分裂来治疗或缓解NEC至今尚未见报道。本研究将从NMU促进肠粘膜细胞分裂增殖和抑制细胞凋亡等方面进行探索。

1 材料与方法

1.1材料 新生SD大鼠由上海斯莱克有限公司提供[SCXK(沪)2017-0005]。NMU、TUNEL试剂盒、PCNA、免疫组化试剂和配方奶分别由Peprotech、碧云天公司、PCNA、中杉金桥和Petag公司提供。

1.2方法

1.2.1动物实验 30只新生大鼠，性别不限，平均体重6 g，随机分为3组，每组10只，分别为正常对照组(A)、NEC模型组(B)和NMU治疗组(C)。A组小鼠采用母鼠正常喂养，B组和C组小鼠采用人工配方奶粉喂养、低高氧暴露和冷刺激方法，即新生大鼠在100% CO2高氧舱环境中保持10 min，4 ℃环境中5 min，然后保持97% O2环境中5 min，每天早晚两次，连续3 d。第4 d开始，B组注射等量的生理盐水，C组腹腔注射NMU(1 mg/kg·d)，每天一次，连续3 d。第 7 d对所有大鼠实施安乐死后，取胃肠道组织行组织病理学检测。

1.2.2肠道组织病理学检查 将肠道组织样品用 4%多聚甲醛固定24 h，再进行常规石蜡包埋切片和HE染色。肠道组织病理结果采用新标准双盲法计分[3]：无组织学损害为0分；轻度粘膜下层和固有层分离为1分；粘膜下层和固有层中度分离，粘膜下层及肌层水肿为2分；粘膜下层和固有层严重分离，严重水肿，局部绒毛脱落为3分；绒毛全部丢失或坏死为4分。分数≥2被定义为NEC。

1.2.3免疫组织化学法 免疫组织化学法检测大鼠肠道上皮组织中增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)的表达变化，具体而言，先进行常规石蜡包埋切片并脱蜡至水，用3%双氧水灭活内源性酶10 min，用pH 9.0的EDTA微波炉中高火20 min修复抗原，经5% BSA室温封闭20 min后，一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤后加二抗于37℃孵育20 min，再经DAB显色及苏木素复染，酒精脱水，用中性树脂胶封片并镜检。

1.2.4细胞凋亡检测 按常规方法进行石蜡的包埋切片并脱蜡至水，利用原位末端标记(TUNEL)法检测肠道上皮细胞的凋亡情况,具体按照试剂盒说明书上步骤进行操作，最后用抗荧光淬灭剂封片液封片并镜检。

1.2.5图像分析 随机抽取 5 张免疫组化结果图，并用IPP 6.0进行半定量分析，统计PCNA阳性率；细胞凋亡统计方法为每个切片随机选取5个视野计数每200个细胞中凋亡细胞数,计算细胞凋亡率。

2 结果

2.1生长发育情况 A组大鼠无异常，生长发育良好。B组大鼠在NEC造模3 d后精神萎靡，并出现明显的腹泻症状，体重显著下降。C组大鼠活动量减少，体重略有下降，腹泻症状比B组轻。

2.2肠道组织病理学比较 三组大鼠肠道组织HE染色结果，如图1所示。A组：组织结构清晰正常，上皮完整连续，绒毛无水肿，黏膜层、黏膜下层及固有层无充血水肿及断裂分离；B组：肠组织坏死严重，绒毛变性水肿，排列不规则，肌层变薄甚至断裂，固有层与黏膜下层重度水肿。C组肠组织出现部分坏死，部分绒毛变性水肿，黏膜下和固有层水肿也较轻。三组大鼠双盲法病理评分及组间比较结果显示(表1): NEC模型组较正常对照组肠道损伤显著加重 (P<0.01)，治疗组肠道损伤较模型组显著减轻 (P<0.01)。

图1 大鼠肠道组织HE染色光镜观察(HE,×200)

表1 大鼠病理学比较

注：B和C与A比较，aP<0.01，C与B比较，bP<0.01

2.3PCNA 在肠上皮细胞的表达变化 如图2所示，PCNA蛋白主要在细胞核内表达，A组肠上皮和肠绒毛细胞核中表达强阳性，B组肠上皮有表达，肠绒毛中表达较低，呈弱阳性，C组较B组明显肠上皮和肠绒毛表达增强，呈阳性，表达强度较对照组略低。半定量分析结果差异有统计学意义(表2)。

2.4肠黏膜上皮细胞凋亡 原位末端标记的检测结果，如图3所示，TUNEL阳性的细胞核呈红色, 主要分布在肠绒毛的顶部和肠黏膜上皮。计数结果显示,B组小肠黏膜上皮细胞TUNEL阳性的细胞数明显多于A组(P<0.01)；C组小肠黏膜上皮细胞TUNEL阳性的细胞数少于B组(P<0.01)(表2)。

表2 肠黏膜 PCNA表达和肠黏膜凋亡

注：B和C与A比较，aP<0.01，C与B比较，bP<0.01

图2 PCNA 在肠上皮细胞的表达变化(SP，×200)

图3 新生大鼠肠道上皮细胞凋亡变化(TUNEL，×200)

3 讨论

NEC是一种十分严重的新生儿肠道炎性疾病，发病儿童中估计有20%～40%需要手术治疗,其中死亡率高达45%[4]。目前NEC的预防和治疗都没有明确的方法。然而肠道功能的维护主要是通过肠黏膜的快速更新来完成的,而细胞增殖是维护肠黏膜的结构与功能的重要机制之一[5]。 PCNA 在细胞DNA复制、细胞增殖及细胞调控中发挥着重要作用[6]。在小肠缺血再灌注损伤时，PCNA 的表达变化与肠道上皮细胞增殖分化相一致，肠道上皮PCNA的表达先降后升，可能与损伤后的肠粘模自身修复相关[7]。NMU的功能主要是刺激平滑肌收缩，影响胃肠功能，调节摄食和能量平衡，然而，NMU是否能通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡来缓解或治疗NEC尚未见报道。

本研究发现：与正常新生大鼠肠上皮中PCNA表达强阳性相比，NEC模型组PCNA阳性细胞率大幅降低，说明上皮组织的细胞增殖受到显著抑制，而NMU治疗后细胞增殖功能得到明显增强，表明NMU对肠粘膜发挥较好的保护作用。

同时，正常新生大鼠肠道上皮细胞凋亡率极低，NEC模型组凋亡率显著升高，而NMU治疗后上皮细胞凋亡率得到了降低，表明NMU能很好的抑制肠道上皮细胞的凋亡。总之，NEC时肠道细胞凋亡增加，应用NMU治疗后能减轻肠道凋亡，促进肠道增殖。