白细胞介素-18基因多态性与汉族人群炎症性肠病的相关性

郭茂东 丁进 胡敏鹂 沈敏瑾 吴珍萍 王群英*

炎症性肠病（IBD）主要包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），是一组慢性非特异性肠道炎症性疾病，病因至今未明。近年来，有研究发现IBD患者肠黏膜与血清IL-18表达增加有关［1］，且血清IL-18表达水平与疾病的严重程度密切相关［2］。本研究拟在浙江汉族人群中探讨IL-18基因（rs1946518和rs187238）2个SNP与IBD易感性的关系，为进一步揭示IBD遗传免疫学机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年1月至2018年2月金华市中心医院、金华市人民医院消化内科门诊和住院确诊的UC患者96例，男54例，女42例；平均年龄（42.78±14.32）岁。其中吸烟者24例，不吸烟或已戒烟者72例。CD患者73例，男40例，女33例；平均年龄（41.02±13.74）岁。其中吸烟者19例，不吸烟或已戒烟者54例。IBD诊断标准根据中华医学会消化病学分会2012年广州会议制定的“炎症性肠病诊断与治疗的共识意见”。依据结肠镜表现将UC病变部位分为左半结肠炎（63例）和广泛结肠炎（33例）。UC病情严重程度分为轻中度（67例）和重度（29例）。CD病变范围分为回肠型（26例），结肠型（24例），回结肠型（23例），疾病行为分为非狭窄非穿透型（41例），狭窄型（11例），穿透型（21例）。同期在金华市中心医院体检中心收集体检健康者114例为对照组，其中男65例，女49例；平均年龄（40.58±10.77）岁。吸烟者29例，不吸烟或已戒烟者85例。所有研究对象在入组前经各项实验室检查排除肠结核、感染性肠炎、缺血性结肠炎、肿瘤及哮喘、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。UC组、CD组与对照组年龄、性别构成比及吸烟者比例比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。以上研究对象均为无血缘关系的浙江汉族人群。所有入选者均签署知情同意书，本项目经浙江大学金华医院伦理委员会批准。

1.2 方法 （1）DNA提取：取外周静脉血约3ml，EDTA-Na2抗凝。用血液基因组DNA提取试剂盒提取全基因组DNA。置于-20℃冰箱冻存。（2）改良多重高温连接酶检测反应技术检测IL-18（rs1946518、rs187238）基因多态性。①多重PCR获取目的基因片段：PCR扩增引物由上海生物工程技术有限公司合成，序列如下：rs1946518（上游引物：5'CCCCTTCCTCCCAAGCTCAATA 3'； 下 游 物 ：5'CCCTCTCCCCAAGCTTACTTTCTG3'。rs187238（ 上 游引物：5' GAAGGTGGAGGGAGGAGACTGC3'；下游引物 ：5' GAAGGCACAGAGCCCCAACTTT3'。PCR 总 反应体系20μl，包含1x HotStarTaq缓冲液，3.0mmol/L Mg2+，0.3mmol/L dNTP，1U HotStarTaq 聚合酶，1μl模板DNA和1μl多重PCR引物（引物浓度：1mmol/L）。反应条件 ：95℃ 2min ；94℃ 20s，65℃ 40s（每个循环减0.5℃），72℃ 1.5min，共11个循环；94℃ 20s，59℃ 30s，72℃ 1.5min，共24个循环；72℃ 2min；置于4℃保存。②多重PCR产物纯化：在10μl PCR产物中加入5U虾碱性磷酸酶（SAP，美国Promega 公司）和2U核酸外切酶（Exo I，美国Epicentre公司），37℃温浴1h，然后75℃灭活15min。③iMLDR连接反应：连接反应体系包含10x连接缓冲液1μl，纯化后多重PCR产物2μl，双蒸水6μl，高温连接酶0.25μl，5'连接引物混合液（1μmol/L）0.4μl，3’连接引物混合液（2μmol/L）0.4μl，连接酶引物序列分别为（rs1946518：FG5' TTCCGCGTTCGGACTGATATGCCA CACGGATACCATCATTAGAATTTTCTG3’；FP5'TAATA ATTTTTACACTTTCTGCAACAGAAAGTAAGTT3'；FT5'T ACGGTTATTCGGGCTCCTGTGCCACACGGATACCATCA TTAGAATTTTCTT3'）；rs187238：RC5'TGTTCGTGGGC CGGATTAGTGAGCCCCAACTTTTACGGAAGAACAC3'；RG5'TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTGAGCCCCAACTTT TACGGAAGAACAG3'；RP5'ATTTCATGAAAATAGTGA TATTACATTAAAAGAAGTACTCTTT 3'）。 连 接 反 应 条件：94℃ 1min，56℃ 4min，共38个循环；置于4℃保存。④基因型判读：取0.5μl稀释后的连接反应产物，与9μl甲酰胺、0.5μl内标混匀，95℃变性5min后用ABI 3730XL测序仪（美国ABI公司）测序。最后采用GeneMapper 4.1软件（美国ABI公司）判读基因型。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料用χ2检验；计量资料用两独立样本t检验。采用非条件Logistic回归分析IL-18基因的2个SNP位点的等位基因和基因型频率在UC组、CD组和对照组间的分布差异，以及2个SNP对UC和CD患者临床病理特征的影响。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UC组、CD组和对照组间IL-18（rs1946518和rs187238）基因多态性的分布比较 对照组中IL-18（rs1946518和rs187238）两个多态性位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=0.752、1.364，P=0.386、0.243）。将UC组和CD组分别与对照组比较，结果发现UC组中rs1946518位点纯合子基因型（TT）频率显著低于对照组（16.67% vs.34.21%，P=0.005，OR=0.385，95%CI：0.198～0.745）；而上述两个 SNP位点的等位基因和基因型频率在CD组和对照组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 IL-18基因多态性在IBD患者和对照组之间的比较［频次（%）］

2.2 IL-18（rs1946518和rs187238）基因多态性与IBD临床病理特征的关系 采用非条件Logistic回归分析IL-18各位点的等位基因和基因型频率与UC、CD临床病理特征的关系。纳入回归的因变量包括年龄、性别和吸烟，结果发现IL-18（rs1946518）位点的基因多态性与UC患者的病变部位有关（P＜0.05）。与广泛结肠炎比较，远端结肠炎患者中（rs1946518）位点基因型（GG+GT）频率明显升高（88.88% vs.72.73%，P=0.044，OR=3.00，95%CI：1.001～8.989）；而上述两个位点的等位基因及基因型频率分布在轻中度UC患者和重度UC患者间比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。在CD患者中，根据疾病行为和疾病部位进行分层分析，结果发现IL-18（rs1946518和rs187238）基因多态性与CD疾病行为及疾病部位均无关（P＞0.05）（见表3、4）。另外，Logistic回归分析还发现IL-18基因上述各位点的等位基因和基因型频率与UC、CD的年龄、性别及吸烟均差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 IL-18基因多态性与UC患者临床病理特征的关系［频次（%）］

表3 IL-18基因多态性与CD患者疾病行为的关系［频次（%）］

3 讨论

目前认为，rs1946518和rs187238定位于IL-18基因第二外显子启动子调控区域，是IL-8基因上最常见的2个功能性单核苷酸多态性位点，在调控IL-18蛋白转录表达中具有重要作用［3］。研究表明，rs187238位点G等位基因含有一潜在的组蛋白H4（H4TF-1）结合位点，当该位点发生G→C突变后将导致H4TF-1结合位点缺失，从而造成IL-18基因的表达活性降低［4］。而rs1946518位点发生的G→T突变后将直接导致转录因子cAMP 应答元件结合蛋白（CREB）去磷酸化，阻断其与 DNA 片段上的 c AMP应答元件（CRE）结合，从而抑制 CRE 调控的IL-18基因表达［4］。Violetta 等在针对来自健康人群的单个核细胞研究结果发现rs1946518位点纯合子TT基因型携带者血清IL-18蛋白表达水平显著低于TG基因型及GG基因型个体。另一项来自下肢深静脉血栓患者人群中的研究表明rs187238 GG基因型携带者血浆IL-18表达水平高于GC+CC基因型携带者［5］。

本资料结果显示，IL-18（rs1946518和rs187238）2个SNP位点的等位基因和基因型频率在对照组和CD组间分布差异均无统计学意义，表明IL-18基因多态性与浙江汉族人群CD的易感性无关。与对照组比较，UC组 IL-18（rs1946518）纯合子基因型TT频率显著降低，提示rs1946518基因突变后降低UC的发病风险。这一结论与来自亚洲人群的Meta分析研究发现基本一致［6］。Ben等对突尼斯人群的研究表明尽管IL-18基因与CD无关，但rs187238纯合子基因型GG携带者罹患UC的风险是其他基因型携带者的1.99倍［7］。而来自德国人群的研究却表明rs187238基因多态性与UC的易感性无关［8］。在日本人群中，Takagawa等亦报道IL-18基因2个SNP与CD无关［9］。最近一项纳入1930例CD和1930例对照的大样本Meta分析显示，IL-18（rs1946518、rs187238）是亚洲人群及非洲人群的CD易感位点，但与高加索人群CD易感性无关［10］。这些来自不同人群的研究结果表明，IL-18基因多态性对IBD的影响可能与种族遗传差异密切相关。

本研究进一步组内分层分析发现，L-18（rs1946518）基因多态性与UC临床病理特征相关。与广泛结肠炎患者比较，远端结肠炎患者中基因型（GC+CC）频率升高，提示携带rs1946518（GC+CC）基因型UC患者更易发生远端结肠炎。目前有关IL-18基因多态性影响UC疾病部位的分子机制尚不明确。有研究发现尽管单个核细胞分泌IL-18水平受其遗传多态性影响，但外源性抗原激活单个核细胞是促发IL-18表达的重要条件。值得注意的是，IL-18基因多态性对IL-18表达的影响只在某些特定的激活剂如细菌脂多糖、抗CD3/CD28抗体诱导下呈现，而在其他激活剂如植物血凝素（PHA）诱导下，其基因多态性对IL-18表达无影响［7］，这表明IL-18基因的表达与环境因素密切相关。由于人类结肠不同肠段中肠道菌群及黏膜微环境存在差异，因此作者推测IL-18基因对UC疾病部位的影响可能是其遗传多态性和肠道微环境差异等多方面因素综合作用的结果。

综 上 所 述，IL-18（rs1946518、rs187238） 基因2个SNP与浙江汉族人群CD的易感性无关，而rs1946518基因突变不仅可能增加UC的发病风险，还可能影响UC患者的疾病部位。需要指出的是，由于体内IL-18信号所介导的炎症反应和免疫应答错综复杂，我们尚不能完全诠释该信号途径对UC发病机制的潜在影响，这有待于进一步研究探讨。