AGR2对低氧微环境下A549细胞迁移和侵袭的影响

阎岩 陆盺冶 宋楠南 董芳 茅安 陆中元

近年来研究表明，低氧微环境可通过多种途径促进非小细胞肺癌细胞的侵袭和转移，是决定恶性肿瘤预后的重要因素之一。低氧可引起肿瘤细胞中低氧诱导因子（HIFs）家族成员表达升高及活性增强，进而上调其下游基因的表达，促进肿瘤细胞的生长及侵袭［1-3］。既往研究发现，低氧可通过HIFs家族中的低氧诱导因子1（HIF-1）上调胶质母细胞瘤及乳腺癌等多种癌细胞中前梯度蛋白2（AGR2）的表达。AGR2在包括食管癌、胰腺癌、前列腺癌及乳腺癌在内的多种人类腺细胞癌中均表达升高。大量体内及体外研究证实，AGR2在促进癌细胞生长、侵袭、转移及耐药等方面均发挥重要作用［4-5］。2018年8月至10月作者通过实验研究，探讨AGR2对低氧环境下A549细胞迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞的培养和处理 A549培养于含有10%胎牛血清的F-12K培养基中，常规培养条件为37℃，5%CO2，20% O2。当细胞培养至融合90%后，用0.25%胰酶-EDTA消化传代，所有试验均采用对数生长期细胞。当细胞生长融合至约50%，采用Lipofectamine 2000转染试剂盒（Invitrogen公司）将终浓度为50 nmol/L的人AGR2特异性小干扰RNA（siAGR2）或其阴性对照序列（siScramble）转入A549细胞。转染24h后，将细胞在无血清培养基中饥饿过夜，然后转入三气培养箱（1% O2）中培养24h。

1.2 蛋白质免疫印迹（Western Blot） 将6孔板中的A549细胞用PBS洗涤3次，然后加入含有1mmol/L蛋白酶抑制剂的SDS裂解液充分裂解细胞。4℃ 12000r/min条件下离心10min后收集上清液。采用BCA法测定收集上清液浓度，并据此配平各样品，以保证每孔上样30μg蛋白样品。SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜，并用5%脱脂奶粉室温封闭1h。分别采用AGR2抗体（Abcam公司）和β-actin抗体（Proteintech公司）孵育过夜。TBST缓冲液洗膜3次后，在室温下孵育二抗1 h。采用ECL化学发光法进行检测。

1.3 荧光实时定量PCR 处理后的A549细胞用PBS洗涤3次，每孔中加入1ml TRIzol提取总RNA，检测RNA样品在A260与A280处的吸光度值，计算RNA浓度。按Primescript RT逆转录试剂盒（TaKaRa公司）步骤行逆转录合成cDNA。根据SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（TaKaRa公司）说明书配制20μl反应体系进行qRT-PCR反应，每个样本设3复孔。实验所用的引物序列：AGR2上游引物：5'-ACAAAGGACTCTCGACCCAAA-3'， 下 游 引 物 ：5'-GTGGGCACTCATCCAAGTGA-3'； GAPDH（内参照基因）上游引物：5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'，下游引物：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。

1.4 Transwell实验 在Transwell上室中加入浓度为 0.2μg/μl的 Matrigel，然后 37℃下孵育 30min使Matrigel 聚合成凝胶。将各组细胞用无血清DMEM培养基制成单细胞悬液，调整细胞密度至5×105/ml，每个小室中加入细胞悬液200μl，每组重复3孔。Transwell 下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，每孔600μl，然后低氧培养24h。擦去上室凝胶后4%多聚甲醛固定15min。室温晾干小室后采用结晶紫染色20min。200倍显微镜下计数中间及四周5个视野细胞数，计算平均值。

1.5 平板划线实验 取6孔板中培养的A549细胞，当细胞生长至80%融合，用200μl无菌移液器枪头在培养板底中央做出划痕。然后用PBS缓冲液洗涤3次以洗脱划下的细胞残渣，用记号笔在板底划线处做记号等分划痕后，在倒置显微镜下拍照起始划痕状态（0h）。低氧环境下培养24h后，拍照、计数迁移细胞数，每孔计数3个视野，每组3个复孔。以迁移至划痕内的细胞个数作为A549迁移能力的定量指标。

1.6 生存分析 采用在线工具Kaplan-Meier Plotter对肺腺癌患者的生存期进行荟萃分析。进入在线工具后输入AGR2，选择总生存期（OS）和肺腺癌选项（n=720），即可计算中位生存期并绘制生存曲线。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0软件及GraphPad Prism 6软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低氧诱导AGR2表达上调 分别采用RT-PCR和Western blot方法检测常氧和低氧条件培养的A549细胞中AGR2 mRNA和蛋白的表达。结果显示，低氧环境能够明显上调A549细胞中AGR2的表达，见图1。

图1 低氧可上调A549细胞系中AGR2的表达

2.2 siAGR2干扰效率的验证 转染AGR2特异性siRNA及对照siRNA于A549细胞48h后，分别采用RT-PCR和Western blot方法检测AGR2 mRNA和蛋白的表达变化。与对照组（siScramble）比较，AGR2的mRNA及蛋白表达水平均显著下调（P＜0.05），提示siRNA能够有效抑制AGR2在A549细胞中的表达（见图 2）。

2.3 干扰抑制AGR2对低氧环境下细胞侵袭能力的影响 A549细胞分别转染siAGR2和siScramble，低氧培养24h后采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。与对照组（siScramble）比较，siAGR2组中穿越Matrigel屏障的浸润细胞数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示靶向沉默AGR2的表达能够显著抑制低氧环境下A549细胞的侵袭能力（见图3）。

图2 AGR2 siRNA能有效抑制a549细胞系中AGR2的表达

图3 AGR2 siRNA 抑制缺氧诱导的A549细胞侵袭

2.4 干扰抑制AGR2对低氧环境下细胞迁移能力的影响 平板划线实验结果提示，与对照组比较，siAGR2组中迁移至划痕内的细胞数显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示抑制AGR2的表达能够显著抑制低氧环境下A549细胞的迁移（见图4）。

图4 AGR2 siRNA 抑制缺氧诱导的A549细胞迁移

2.5 AGR2对肺腺癌患者生存期的影响 鉴于靶向沉默AGR2能够明显抑制低氧微环境对A549细胞侵袭、迁移的促进作用，根据AGR2的表达差异对肺腺癌患者的生存期进行荟萃分析。基于720例患者的临床数据结果发现，高表达AGR2的肺腺癌患者中位生存期为81.1个月，显著低于低表达组（110.27个月），见图5。

图5 AGR2对肺腺癌患者生存期的影响

3 讨论

侵袭转移是肺腺癌的基本生物学特性，也是导致其预后不良的根本原因。肺腺癌细胞的侵袭和转移不仅与细胞本身侵袭能力增强、粘附能力下降有关，还与其所处的肿瘤微环境密切相关。阐明肺腺癌微环境影响其侵袭、迁移的作用及机制，对开发新的治疗策略具有重要意义。

AGR2最早由Kuang等［6］在雌激素受体表达的人乳腺癌细胞株中被筛选发现。自被发现以来，大量证据证实AGR2 在多种人类肿瘤中表达升高，且与肿瘤的发生和转移密切相关。研究发现，低氧微环境能够通过HIF-1诱导乳腺癌、胶质瘤等恶性肿瘤细胞中AGR2表达上调，而AGR2能够与胞内HIF-1蛋白结合，延缓其降解，在肿瘤增殖、血管生成及耐药等方面发挥重要作用［7］。本资料发现，低氧培养能够显著上调肺腺癌细胞系A549中AGR2的表达，提示AGR2可能参与低氧微环境下肺腺癌细胞的生物学特性改变。

肺癌细胞的侵袭性生长和远处转移是导致肺癌患者预后不良的重要原因。近年来研究发现低氧微环境是促使癌细胞发生转移的始动因素［8］。癌细胞的侵袭和迁徙是肿瘤转移不可或缺的环节。大量研究证实低氧微环境可通过上调HIF家族表达、下调细胞间粘附分子以及促进新生血管形成等途径促进肺癌细胞的侵袭、迁移［9-10］。Liu等［5］将转染AGR2过表达载体的乳腺癌细胞接种于大鼠乳腺脂肪垫中，结果发现高表达AGR2的乳腺癌细胞转移率界于77%～92%，而对照组大鼠无一例发生转移，表明AGR2在恶性肿瘤转移过程中发挥重要作用。Wang等［4］研究发现，食管腺癌细胞系SEG-1分泌的AGR2蛋白可显著增强其自身的迁移能力，抑制其表达可明显减小食管腺癌裸鼠成瘤体积。Ramachandra等发现AGR2在多数转移性胰腺癌中表达明显升高。下调AGR2后，胰腺癌细胞的生长被明显抑制，同时其侵袭能力也显著减弱［11］。本资料中，在低氧培养A549细胞的同时通过干扰RNA方法抑制AGR2的表达，结果发现下调AGR2能够明显抑制A549细胞的侵袭、迁移能力，提示AGR2在低氧引起的肺癌细胞侵袭性改变过程中发挥关键作用，沉默其表达可能会改善肺癌患者预后。既往研究也表明，AGR2蛋白在健康人群中的表达量较低，但在非小细胞肺癌患者中的表达显著升高［12］。采用干扰RNA技术抑制AGR2基因可显著减弱肺癌细胞的转移能力［13］。另有研究报道称，AGR2基因是一种与肿瘤转移相关的基因，其在部分高转移性肿瘤的循环肿瘤细胞中表达升高［14］。与上述研究结果一致，基于720例患者的临床数据结果发现，高表达AGR2的肺腺癌患者的中位生存期显著短于低表达组，提示AGR2可作为评估患者预后的标志物，且可作为治疗肺腺癌的潜在靶点。

综上所述，低氧微环境可诱导肺腺癌A549细胞系中AGR2的表达上调，靶向沉默AGR2可有效抑制低氧对肿瘤细胞侵袭、迁移能力的促进作用，有助于进一步认识低氧微环境与肺腺癌转移的相关机制。